Strategie regulace (proteinové) enzymové aktivity.

1. Strategie regulace (proteinové) enzymové aktivity. Allosterická kontrola. Allosterické proteiny obsahují regulační místa odlišná od substrátových. Allosterický z řečtiny „allos“ = další, „steros“ = uspořádání. Skládají se z podjednotek (protomerů). Mají schopnost kooperativity. Jako příklady enzym aspartáttranskarbamoylasa (ATCasa) a neenzymový kyslíkový přenašeč hemoglobin. Mnohočetné formy enzymů. Isozymy – jsou homologní enzymy katalyzující stejnou reakci, ale lišící se jemně v struktuře a více v Km a Vlim a regulačních vlastnostech.

2. 3. Reversibilní kovalentní modifikace. Katalytické vlastnosti řady enzymů se mění po kovalentní vazbě nějaké skupiny na jejich molekulu – nejčastěji fosforylace. Modifikující enzymy jsou proteinkinasy a proteinfosfatasy. • 4. Proteolytická aktivace. Mnoho proteinů je syntetizováno v neaktivní formě. U enzymů jsou to zymogeny (proenzymy). Po odštěpení části řetězce přechází zymogen na aktivní enzym. Jako aktivující složky působí proteolytické enzymy jako chymotrypsin, pepsin a trypsin. Aktivace je ireversibilní. Kaspasy, proteolytické enzymy, účastnící se programové buněčné smrti, jsou aktivovány z formy prokaspas. Dalším příkladem je kaskáda enzymů při srážení krve. 5. Kontrola množstvím přítomného enzymu-kontrola na úrovni transkripce.

3. ALLOSTERIE • Aspartáttranskarbamoylasa jako příklad allosterického enzymu. • Allosterické enzymy se neřídí kinetikou Michaelise a Mentenové. • Modely allosterie: • Symetrický model ( Jacques Monod, Jeffries Wyman a Jean-Pierre Changeux – podle autorů zkracovaný jako MWC model). Angl. concerted (přel. současný) • Sekvenční model (Daniel Koshland). • Conceptual insights – Stryer, Chapter 10. • Hemoglobin je příkladem neenzymového allosterického proteinu

4. Enzym Aspartáttranskarbamoylasa (EC 2.1.3.2) je allostericky inhibován konečným produktem metabolické cesty cytidintrifosfátem (CTP).Inhibice zpětnou vazbou.ATCasa katalyzuje kritický stupeň kondenzace Asp s karbamoylfosfátem při syntéze pyrimidinových nukleotidů.

5. Cytidintrifosfát (CTP) inhibuje ATCasu. Podobnost mezi substrátem a produktem není žádná.

6. Od slide 6 po slide 13 je prezentován způsob objasnění struktury ATCasy. Není podstané pro pochopení principu allosterie !!Modifikace cysteinových vedlejších řetězců (ATCasy). Oddělení podjednotek chromatografií na iontoměniči nebo centrifugací.

7. Centrifugační studie ATCasy. • Centrifugace v gradientu sacharosy. • Sedimentační koeficient nativního enzymu je 11,6 S. • Dvě podjednotky 2,8 S a 5,8 S. • Svedberg (zkratka S či Sv), též Svedbergova jednotka, je odvozená jednotka fyzikální veličiny známé jako sedimentační koeficient. • Tato veličina udává čas, za který proběhne sedimentace dané makromolekuly při její ultracentrifugaci. • Platí: 1 Svedberg = 1 S = 10-13 sekundy • Jak od sebe oddělíme obě podjednotky a jak lze odstranit p-hydroxymerkuribenzoát ? • Větší podjednotka (c) je katalytická, ale není inhibována CTP. Složena ze tří řetězců po 34 kD se označuje c3. • Regulační podjednotka (r) váže CTP. Složena ze dvou řetězců po 17 kD je označena r2. • Nativní enzym je složen ze dvou katalytických trimerů a tří regulačních dimerů (2 c3 + 3 r2 = c6r6).

8. Ultracentrifugační studie ATCasy. A) Sedimentační rychlost nativní ATCasy. B) Enyzm po působení p-hydroxymerkuribenzoanu. Enzym disocioval na regulační (r) a katalytické podjednotky (c).

9. Kvarterní struktura ATCasy. Vpravo je zjednodušený pohled. Katalytické trimery jsou dva (druhý je zakrytý). Regulační dimery jsou tři. 2 c3 + 3 r2 = c6r6

10. Strukturní podobnost mezi reakčním produktem ATCasy N-fosfonokarbamoylaspartátem a PALA (bisubstrátový analog reakčního meziproduktu). Krystalizace ACTasy za přítomnosti PALA - lokalizace aktivního místa.

11. Aktivní místo ATCasy-trimer. V aktivním místě, které obsahuje hlavně vedlejší skupiny z jedné podjednotky, ale také část druhé podjednotky (zeleně), je vázán PALA.

12. ATCasa existuje ve dvou konformacích: kompaktní , relativně inaktivní označovaná jako T (tense) a uvolněná (relaxed) označovaná R. PALA stabilizuje R stav.ATCasa splňuje kritéria symetrického modelu.

13. Cytidintrifosfát (CTP) stabilizuje T stav. CTP se váže na regulační podjednotky ATCasy.

14. T a R stavy v rovnováze. I v situaci bez přítomnosti substrátu existuje ATCasa v rovnováze obou stavů. Bez substrátu převažuje T nad R stavem faktorem 200.

15. ATCase vykazuje sigmoidní kinetiku. Základní podmínka allosterie proteinu: a) Kvartérní struktura (složen z podjednotek). b)Závislostrychlosti enzymové reakce na koncentraci substrátu je esovitá křivka – sigmoidní tvar.

16. Tvorbu sigmoidní křivky lze interpretovat jako směs dvou Michaelis-Mentenovských enzymů, jeden s vysokou hodnotou KM odpovídající T stavu a druhý s nízkou hodnotou KM odpovídající R stavu. S růstem koncentrací substrátu se rovnováha posunuje od T k R stavu.

17. Vliv CTP na kinetiku ATCasy. CTP je allosterický inhibitor, stabilizuje T stav. Znesnadňuje vstup substrátu do aktivního místa.

18. Vliv ATP na kinetiku ATCasy. ATP je alosterický aktivátor. Stabilizuje stav R – usnadněný vstup substrátu do aktivního místa.

19. Působení substrátů na allosterické enzymy se označuje jako homotropní efekt (z řečtiny „stejný“). • Působení nesubstrátových molekul na allosterické enzymy jako např. CTP a ATP na ATCasu se označuje jako heterotropní efekt. • Zkuste uvažovat proč působí ATP jako aktivátor ATCasy (fyziologická úvaha).

20. Glukokinasa • Glukokinasa (EC 2.7.1. 2), systematický název: ATP:D-glukosa 6-fosfotransferasajeenzym katalyzující fosforylaci glukosy na glukosa-6-fosfát. Glukokinasa je přítomna v buňkách jater, pankreatu, mozku, střevě lidí a mnoha obratlovců. V každém z těchto orgánů hraje významnou roli při regulaci metabolismu sacharidů. Působí jako glukosový sensor. Reaguje na změny hladin glukosy při hladovění nebo nasycení. • Glukokinasa (GK) je hexokinasový izozym homologní s dalšími hexokinasami. • GK je kódovaná odlišným genem, na rozdíl od hexokinas, má také odlišné kinetické vlastnosti a s tím související různé odlišné funkce. • GK má, na rozdíl od ostatních hexokinas, nižší afinitu ke glukose a její aktivita je lokalizována jen v několika typech buněk.

21. Glukokinasa • GK mění svoji strukturu v závislosti na koncentraci glukosy. Je saturována při koncentraci glukosy 8 mM/L. • GK není inhibována produktem – glukosa-6-fosfátem !!!! • GK vykazuje, ač monomer, kooperativitu – allosterické chování !!! • GK je monomer 465 aminokyselin o molekulové hmotnosti 50kD. Na molekule enzymu jsou dvě vazebná místa. Jedno pro substráty (aktivní místo) vážící glukosu a MgATP a druhé, pravděpodobně, pro allosterický aktivátor-inhibitor, které dosud nebyly jednoznačně identifikovány. Ostatní hexokinasy jsou dimery. • GK – aktivita může být zvyšována nebo redukována v minutových intervalech glukokinasovým regulačním proteinem(GKRP).

22. Glukokinasa s v aktivním místě vázanou glukosou

23. Dva modely allosterie. • Symetrický model ( Jacques Monod, Jeffries Wyman a Jean-Pierre Changeux – podle autorů zkracovaný jako MWC model). • Sekvenční model (Daniel Koshland).

24. Conceptual insights – Chapter 10.

25. Kvantitativní popis modelu MWC. Frakční aktivita Yf je část aktivních míst s navázaným substrátem úměrná reakční rychlosti. aje poměr [ S ] / disociační konstantě S s enzymem ve stavu R; L je poměr koncentrací enzymu ve stavu T k enzymu ve stavu R. Vazba regulátorů ATP a CTP mění hodnotu L.

26. Symetrický (MWC) model – kvantitativní formulace. • Mějme enzym s n aktivními místy. • Dva stavy enzymu v rovnováze: R – vysoká afinita k substrátu, T - nízká afinita k substrátu. Definujeme c jako poměr afinit obou forem enzymu k substrátu S, měřeno jako disociační konstanty.

27. Frakční aktivita Y, je frakce aktivních míst s navázanými substráty. Je přímo úměrná reakční rychlosti. aje poměr [ S ] ku disociační konstantě S v komplexu s enzymem v R stavu. • L je poměr koncentrace enzymu v T stavu ku koncentraci enzymu v R stavu (KR). • Vazba regulátorů jako je ATP nebo CTP na ATCasu mění hodnotu L a tím odezvu na koncentraci substrátu.

29. Příklad využití kvantitativního modelu s daty ATCasy. • U ATCasy se n = 6. • Vynikajícího souhlasu s experimentálními daty se dosahuje při L = 200 a c = 0, 1. • Z toho plyne, že za absence vázaného substrátu je posunuta rovnováha na stranu T faktorem 200 ( pouze 1 molekula z 200 je ve stavu R) a afinita R stavu k substrátu je 10x vyšší než ke stavu T. Když se substrát váže do každého aktivního místa, rovnováha se posouvá k R. • Např.:Pokud je obsazena polovina aktivních míst substrátem(tři ze šesti) je poměr T/R 1 : 5. Znamená to, že téměř všechny molekuly jsou ve stavu R.

30. Vliv CTP a ATP se řeší jednoduše změnou hodnoty L. • Při saturaci CTP se hodnota L zvyšuje na 1 250. To znamená, že je třeba daleko více substrátu k posunu rovnováhy do stavu R. Při saturaci ATP klesá hodnota L na 70.

31. SEKVENČNÍ MODEL • Daniel KOSHLAND – postupná vazba ligandů (substrátů) na podjednotkyproteinu vede k postupnému vzájemnému ovlivňování jednotlivých podjednotek. • Možno vysvětlit i negativní kooperaci. • U symetrického modelu (MWC) přechází celý enzym z jednoho stavu do druhého (T a R).

32. Jednoduchý sekvenční model tetramerního allosterického enzymu. Postupnou vazbou substrátu na podjednotky se mění konformace okolních ze stavu T na R.

33. Max Perutz (1914 – 2002) a John Kendrew – Nobelova cena za chemii v roce 1962. • Max Perutz pracoval na rentgenové struktuře Hb více než 30 let na Univerzitě v Cambridge (UK). Struktura o rozlišení 2, 8 Å byla získána až v roce 1968. • John Kendrew navazoval na M. Perutze, Objasnil strukturu velrybího myoglobinu – rentgenostrukturní analýzou, metodou isomorfní záměny. Těžký atom jako Hg2+ (bohatý na elektrony) se musí vázat na protein, tak, aby nedošlo ke změně struktury. Dochází k podstatné změně v intenzitě odrazu, ale ne v pozici elektronové hustoty.

34. Kvartérní struktura hemoglobinu – dva řetězce a a dva b tvoří pár ab dimerů – heterotetramer a2b2.

35. Kooperativní zvýšení transportu kyslíku u hemoglobinu. Kooperativita mezi vazebnými místy pro kyslík vede k zásobení tkání větším množstvím kyslíku (1, 7x) než by mohl nekooperativní protein. (pO2 je parciální tlak kyslíku).

36. Jednotky tlaku • 1 torr = 1 mm Hg ≈ 133,322 Pa • Pascal (značka Pa) je základní jednotka tlaku. Udává, jak velká síla (v Newtonech) působí na jednotkovou plochu (1 m2), tzn. je ekvivalentní N/m². • 1 hPa = 100 Pa = 1 mb (milibar)1 Pa = 1 N/m21 hPa = 100Pa1 kPa = 1000 Pa • 760 torrů ≈ 101,325 hPa • 1 atm = 101 325 Pa = 101,325 kPa = 0,101325 MPa = 760 torr • Parciální tlak plynu ve směsi je tlak, který by tento plyn vykazoval, pokud by byl v celém objemu sám.

37. Krevní oběh – srdce a plíce. Formy Hb: HbO2 = oxyhemoglobin, deoxyhemoglobin, Mb = svalový myoglobin.

38. Karbonátanhydratasa EC 4.2.1.1 (metaloenzym – Zn2+) Zkratka CA.

39. Aktivní místo živočišné a-CA (Zn2+ je vázán na tři imidazolové zbytky His)

40. Reakce katalyzované CA. • Reakce katalyzovaná CA: • CO2 + H2O  HCO3- + H+ (za situace vysoké koncentrace CO2 v tkáních) • Velmi rychlá reakce – 104 až 106 obratů za sekundu (číslo přeměny). Limitováno jen difůzí !!! • Zpětná reakce: • HCO3- + H+ H2CO3 CO2 + H2O (v plících a nefronech ledvin za stavu nízké koncentrace CO2 , v rostlinách).

41. Funkce CA • Primární funkcí CA u živočichů je udržování rovnováhy mezi CO2 a hydrgenuhličitanem za účelem udržování acidobazické rovnováhy v krvi a tkáních. Další funkcí je role CA při transportu CO2 z tkání. • Existuje 14 různých izoforem CA u savců. • Rostliny obsahují odlišnou formu nazvanou β-karbonátanhydratasa, která je z hlediska evoluce odlišný enzym, ale podílí se na stejné reakci a využívá atom zinku v aktivním místě. U rostlin je úkolem CA zvyšovat koncentraci CO2 v chloroplastech za účelem zvýšení rychlosti karboxylace katalyzované RuBisCem. Reakce fotosyntézy – RuBisCo využívá pouze CO2 a ne uhličitou kyselinu nebo hydrogenuhličitan.

42. Mechanismus působení CA • Prosthetická skupina Zn 2+ v aktivním místě je koordinována třemi His. Čtvrtá koordinační pozice je obsazena molekulou vody. • Dochází k polarizaci vazby vodík – kyslík. Kyslík má negativní náboj a tím je vazba s vodíkem zeslabena. • Čtyři His kolem vody jako substrátu váží proton, což vede k k uvolnění hydroxidové skupiny vázané na Zn. Příklad acidobazické katalýzy. • Aktivní místo také obsahuje specifickou kapsu pro CO2 v těsné blízkosti hydroxidové skupiny. Na elektrony bohatý OH – se váže naoxid uhličity za tvorby hydrogenuhličitanu.

44. Pozice Fe2+ v deoxyhemoglobinu.

45. Vazba kyslíku vede ke strukturním změnám. Atom Fe je vtažen po vazbě kyslíku do roviny hemu. S ním je vtažen i proximální His.

46. Konformační změny v hemoglobinu.Pohyb Fe2+ po vazbě kyslíku vtáhne do kruhu proximální His, který jako součást a helixu ovlivní svým C koncem vztah mezi ab páry vedoucí k dalším strukturním změnám. Porovnáni se strukturou deoxy (šedá).

47. Přechod ze stavu T do stavu R u hemoglobinu.Po vazbě kyslíku na pár a1 b1 se a1 b1 pár pootočí vůči druhému a2 b2 páru o 15o.

48. Posun mezi řetězci b2 a a1 hemoglobinu po vazbě kyslíku. Stavy R vázán kyslík a T bez kyslíku.

49. Symetrický model allosterie. V jedné kvarterní struktuře nemohou existovat vedle sebe formy T a R.

50. Sekvenční model allosterie. Ligand po vazbě na jednu podjednotku progresívně vyvolává konformační změny sousedních podjednotek.