Desde tiempos remotos, se ha estudiado el envejecimiento y la “fuente de la eterna juventud”.

1. Desde tiempos remotos, se ha estudiado el envejecimiento y la “fuente de la eterna juventud”. Arkin, R. Biology of Aging: bservations and principles. 2nd ed. Suderland, Massachusetts: Sinauer;1998.

2. Extensión de la esperanza de vida por la introducción de la telomerasa en células humanas normalesBodnar, GA; Oullette, M; Frolkis, M; et. al. Science 279 (1998): 349 – 352.

3. Introducción

4. Los telómeros • Los telómeros se localizan en los extremos de los cromosomas eucarióticos. • Constituidas por regiones de ADN no codificante. • En los humanos, el ADN del telómero está constituido por TTAGGG, repetidas muchas veces en tandem y perdiéndose sucesivamente durante las divisiones celulares.

5. Función • Mantener estable la estructura de los cromosomas en las células eucariotas.(Protección de exonucleasas). • Ayudan a que los cromosomas homólogos se emparejen y entrecrucen durante la profase de la meiosis. • Cumple como reloj mitótico

6. Telomerasa • Esta formada por un complejo proteína-ácido ribonucleico con actividad polimerasa. • Enzima cuyo rol es mantener la integridad telomérica. • Actuaría elongando los extremos cromosómicos.

7. Actividad de telomerasa en las fases G1, S y G2 del ciclo celular, represión en G0. • Telomerasa = actividad de subunidad catalítica

10. Estructura del telómero • Estructura en doble bucle. • El extremo final se curva sobre su eje formando un gran bucle (t-loop) • El extremo 3’ rico en G se une a las secuencias repetitivas en el extremo 5’ formando un bucle de desplazamiento (d-loop). • La estructura t-loop-d-loop enmascara el extremo 3’libre , lo cual podría tener un rol protectivo.

12. T-loop-d-loop La integridad del telómero requiere: • Un número mínimo de secuencias TTAGGG • La integridad del extremo terminal simple cadena • Proteínas reguladoras: TRF1 y TRF2

13. TRF1 • Formación y estabilización del bucle. • Se une con Pot1 para unir el extremo 3’ libre con las secuencias doble cadena repetitivas. • Su exceso inhibe a la telomerasa. • La unión con TIN2 favorece la compactación del DNA, estabiliza el loop y limita el acceso de la telomerasa. • Sustrato de ribosilasas (Tankirasa 1 y 2). Ribosilado, pierde afinidad por el DNA telomérico dejando DNA libre para la telomerasa.

14. TRF2 • Estabiliza y permite la unión del extremo 3’ libre al DNA doble cadena • Se une a proteínas reguladoras de la longitud del telómero (hRAP1) • Se une a proteínas reparadoras: • complejo MRE11 = repara DNA doble cadena • DNA PK = impide la fusión de los telómeros

15. Unión de TRF2: formación del loop

16. Cél germinales: hTRT+(telomerasa activa)= telómeros 15 kbp • Cél somática: hTRT- (telomerasa inactiva)= telómeros más cortos

17. ¿Es el acortamiento de los telómeros la causa del envejecimiento humano?. • Las células se dividen hasta un punto crítico la “senescencia replicativa” en la cual los telómeros han alcanzado una determinada longitud debido a su acortamiento progresivo por las sucesivas divisiones. • Senectud división acumulativa NO TIEMPO CRONOLÓGICO.

18. Objetivos • Demostrar si es posible activar la telomerasa en células somáticas (hTRT). • Determinar si está expresión prolonga la esperanza de vida celular • Lograr la elongación de los telómeros con la activación de la telomerasa • Determinar sí la pérdida de telómeros controla la entrada en la senectud replicativa. • Determinar el promedio de divisiones celulares en células hTRT- y hTRT+, antes de entrar a la senescencia.

19. Hipótesis del envejecimiento celular Las células se dividen hasta un punto crítico la “senescencia replicativa” en la cual los telómeros han alcanzado una longitud crítica debido a su acortamiento progresivo por las sucesivas divisiones.

20. INTRODUCCION DE TELOMERASA EN CELULAS HUMANAS OBJETIVO : TRANSFECTAR CELULAS NORMALES hTRT– CON 2 DIFERENTES VECTORES cDNA hTRT

21. A) Construcción del primer promotor de expresión  fue creado para aumentar la eficacia de la traducción por separación de la región 5´-3´ no codificante y creación de un consenso kozak. • Secuencia de consenso: Secuencia ideal que representa los nucleótidos que se encuentran con mayor frecuencia en un fragmento de ADN. Es una secuencia breve de nucleótidos que suele servir de sitio de reconocimiento para ciertas proteínas • El cDNA hTRT fue clonado utilizando como promotor el PGRN145 del virus del SARCOMA MIELOPROLIFERATIVO (MPSV).

22. TRANSFECCIÓN células (RPE – BJ ) ELECTROPORACION – TRANSFECCION vector control vector hTRT + consenso kozak

24. CULTIVO • después de 48 hrs. las células se trasladaron a un medio con HYGROYCIN–B (50 ul/ml durante dos a tres semanas, después se redujo la concentración a 10 ul/ml ). • Los clones estables fueron analizados por TRAP ( Telomeric Repeat Amplification Polimerase).

25. TRAP ASSAY • El método de TRAP (Telomeric Repeat Amplification Protocol), basado en la técnica de PCR, permite detectar la presencia de actividad de telomerasa en extractos celulares utilizando primers de regiones teloméricas

26. TELOMERIC REPEAT AMPLIFICATION PROTOCOL

28. Para medir el rango de producción telomerasa se utilizo como referencia la actividad telomerasa de la línea celular H1299 de cáncer de pulmón humano. • Los clones RPE expresaron un rango de actividad de 65 a 360% de actividad telomerasa. • Los clones BJ expresaron de 86 a 95% de actividad de telomerasa.

29. RESULTADOS – 1ER TRANSFECCIÓN • 27 de 39 clones estables RPE transfectadas con MPSV- hTRT expresaron actividad de telomerasa ( 69 %) . • 3 de 22 clones estables de BJ transfectado con MPSV- hTRT expresaron actividad de telomerasa.

30. ¿Cómo saber que el hTRT mRNA es originado del clonado y no de un gen endógeno? • El mRNA endógeno del hTRT fue detectado con los primers RA58 y hTRT3’UTR. • El mRNA exógeno del hTRT fue detectado con primers RA58 y el RA55. • La RT-PCR demostró que el mRNA hTRT derivó del cDNA clonado y no del mRNA endógeno.

31. CONSTRUCCIÓN DEL SEGUNDO VECTOR DE EXPRESIÓN • Se clonó un cDNA hTRT completo en el promotor pZeoSV del SV40. célula BJ Electroporación Transfección con hTRT SV40

32. RESULTADOS – 2ª TRANSFECCIÓN • de las células BJ transfectadas con el pZeoSV-hTRT e la división 40, solo 6 de 76 clones estables (8% ) expresaron telomerasa actividad en un rango de 10 a 30% en comparación a la línea celular H1299.. • El hTRT mRNA no era detectable en células BJ negativas (hTRT- ), pero fácilmente observables en clones hTRT+.

33. Medición de la longitud de los telómeros: • Fragmentos de restricción terminal (TRF), secuencias repetitivas (TTAGGG)n obtenidos mediante la digestión de ADN genómico con una enzima de restricción de corte muy frecuente (HinfI), que no corta en el core de las repeticiones • Southern Blot :se detectan poblaciones de longitudes teloméricas de distintos clones celulares utilizando una sonda complementaria (AATCCC) marcada radiactivamente

34. Southern Blot:

35. 1. ¿Qué sucederia si logramos activar la telomerasa en células normales? 2. ¿Es posible alargar los telómeros para conservar la capacidad de la célula de dividirse? 3. ¿Existe algún límite para el alargamiento de los telómeros?

36. Longitud de los telómeros de los distintos clones celulares utilizando TRF en gel de agarosa.

38. Resultados: • RPE hTRT- disminuyeron sus telómeros en 0,4- 1,3 kbp • RPE hTRT+ aumentaron los telómeros en 3,7 kpb • BJ hTRT+ transfectadas con MPSV-hTRT aumentaron los telómeros en 7,1 kpb • BJ hTRT+ transfectadas con pZeoSV-hTRT aumentaron los telómeros en 0,4 kpb • Los clones T30 ( RPE) y B13 (BJ) hTRT+ presentaron actividad telomerasa del 5% y 7% pero no presentaron alargamiento significativo de los telómeros

39. Conclusiones: • Si logramos activar la telomerasa = alargamos la longitud del telómero = la célula puede dividirse, evitando la entrada en SENESCENCIA REPLICATIVA • La sola presencia de actividad hTRT+ no es suficiente. Se requiere una determinada concentración mínima de hTRT +

40. Clones h TRT + ACTIVIDAD TELOMERASA ?  LARGO DEL TELOMERO? 

41. QUE PASA CON LA LONGEVIDAD DE LA CELULAR? • Llegan a senescencia al mismo tiempo que las hTRT - ? • Pueden continuar dividiéndose por más tiempo ? • O el hecho de alargar sus telómeros no tiene implicancia en la senescencia?

42. Las células somáticas normales pierden su capacidad proliferativa tras un número crítico de divisiones • La máxima capacidad de división en cultivo de cel . Somáticas humanas de dadores jóvenes oscila entre 50 y 100 duplicaciones • Este número se reduce si el dador es más adulto.( debido a la historia replicativa de la célula in vivo)

43. Senescencia se relaciona con el acortamiento de los telómeros. Que pasa con los clones h TRT + que expresan la actividad telomerasa?

45. Conclusiones • Los clones RPE h TRT + excedieron el valor normal de senescencia por 20 divisiones mas, y continúan dividiéndose superando el numero máximo ( PD 55 a 57 ) • Los clones BJ HTRT + excedieron el numero máximo de PD ( 36 divisiones mas) • Además de la actividad de la telomerasa en la longevidad de la célula interviene otros factores específicos de cada línea celular. (niveles de hTR, proteinas asociadas)

46. La expresión de h TRT funcional en células normales aumenta el tiempo de vida celular!!

47. B-galactosidasa como marcador de la senescencia

48. B- Galactosidasa • Senectud celular es una progresión de acontecimientos por lo cual las células pasan de dividirse activamente a un estado donde no se dividen, quedando metabólicamente activo. • Diferenciación terminal: Es también un mecanismo genéticamente programado. La célula es incapaz de originar otros tipos celulares u otras células del mismo tipo. A diferencia de las células en **quiescencia** (detenidas en la fase Go del ciclo celular), es un estadio irreversible de donde la célula no logra salir a pesar de la estimulación con factor de crecimiento (FC) y que la lleva a la muerte en poco tiempo. • Quiescencia las células cesan de proliferar , pero retienen la capacidad de dividirse posteriormente, también se denomina a esta detención del proceso en G1 como fase G0 . Estas células pueden entrar de nuevo en fase G1 por estímulos externos y proliferar.

49. Objetivo • Determinar la presencia de la enzima telomerasa transcriptasa reversa (TRT) en las células epiteliales del pigmento retiniano y en los fibroblastos, utilizando la B-galactosidasa como marcador de la senescencia. • Determinar la existencia de cambios morfológicos y funcionales asociados a este fenómeno.

50. Materiales y Metodología Prueba histoquímica para la actividad de B-galactosidasa • Ph 6 • PBS (phosphate buffered saline) • Fijador: formaldehído 2 %, glutaraldehido 0.2 %, formaldehído 0.3 %. • Sustrato artificial X-gal (5 bromo- 4cloro-3 indol- beta D galactósido).