La Technique du Peignage Moléculaire

1. La Technique du Peignage Moléculaire Charlène Chaix Département de génétique médicale Marseille, France --------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- Colloque ATCLF Aix-en-Provence 20/09/2010

2. Le principe • Technique d’analyse de l’ADN • ADN en double hélice ADN peigné (Forme repliée) (Forme étirée)

3. Les étapes du protocole de peignage moléculaire Extraction de l’ADN : préparation des plugs Préparation de la solution d’ADN à partir d’un plug • Peignage de l’ADN • Hybridation • Révélation • Analyse

4. Extraction de l’ADN

5. Préparation de la solution d’ADN

6. Peignage des molécules d’ADN • Molécules d’ADN (100 kb – 2 Mb) • 100 génomes par lame • Facteur d’étirement : 2 Kb / µm • Étirement constant • Fixation irréversible de l’ADN peigné 106 cellules Machine de peignage ADN peigné ( yoyo ) observé au microscope

7. Hybridation et Révélation • Marquage indirect des sondes : Hybridation de sondes spécifiques sur l’ADN peigné incorporant un nucléotide modifié. • Détection des signaux par utilisation d’anticorps couplés à des fluorochromes reconnaissant le nucléotide modifié

8. Résultats • Visualisation des signaux à l’aide d’un microscope à fluorescence automatisé à très haute résolution • Lecture directe : ~ Délétions ~ Translocations… • Précision : 1 Kb 19.5 kb 68 kb 155 kb 51 kb 4.3 kb 126.5kb 114 kb Locus FSHD observé au microscope à fluorescence (IXM)

10. La plateforme actuelle et ses futurs objectifs • Actuellement : Analyse semi-automatique • Prochainement : Transfert de la technologie en diagnostic : • Kit de diagnostic breveté bientôt disponible • Automatisation de l’analyse par le logiciel Visilog