Christian Solis Calero Biofaral@hotmail

1. Universidad Nacional Mayor de SanMarcos Facultad de Farmacía y Bioquímica APROXIMACION BIOINFORMATICA A LA IDENTIFICACION DE DIANAS FARMACOLOGICAS EXPRESADAS DURANTE EL ESTADO DE LATENCIA DE Mycobacterium tuberculosis Christian Solis Calero Biofaral@hotmail.com Lima- Perú 2003 Por Christian Solís Calero Facultad de Farmacía y Bioquímica. UNMSM, Octubre 2003

2. Indice • Introdución • Bioinformática • Genómica Mycobacterium tuberculosis • Antecedentes • Objetivos • Metodología • Resultados • Conclusiones • Agradecimientos

3. BIOINFORMÁTICA Bioinformática es la aplicación de la tecnología de la información a la bioquímica y la biología molecular

4. Procesamiento de SEÑALES Procesamientode DATOS Procesamiento de CONOCIMIENTO MUESTRAS DATOS INFORMACION PREDICCION Estructura tridimensional De Proteína Secuencia de nucleótidos (DNA) Secuencia correspondiente a un gen Secuencia de aminoácidos Procesamiento Computacional

5. Mycobacterium tuberculosis • Agente etiológico de la Tuberculosis, la enfermedad infecciosa que más muertes provoca en el mundo. • La Tuberculosis es un complejo de Fenómenos microbiológicos e Inmunológicos que escapa a una definición simple. • Nuevos Problemas: • Asociación con la infección del virus del SIDA • Resistencia a la acción de los farmacos. • El Mycobacterium tuberculosises capaz de causar tanto un proceso agudo de enfermedad como una infección latente asintomática. un tercio de la población mundial puede estar infectada con el bacilo en este estado

6. Infección en los alveolos Los bacilos se multiplican y se movilizan hacia los ganglios linfáticos traqueobronquiales Hipersensibilidad de tipo retardado e inmunidad mediada por células Positividad conla tuberculina Poca o ninguna hipersensibilidad. Negátividad con la tuberculina Se contiene la enfermedad Las Bacterias viven pero no se multiplican El complejo de Ghon aparece en una fase temprana en el 15% de los casos Enfermedad sístemica progresiva y muerte LATENCIA De estos 6% TBC Clínica - 2% Pulmonar - 3% extratorácica - 1% ambos casos 3% Enfermedad sistémica Progresiva y Muerte. 91% sin enfermedad

7. Mycobacterium tuberculosis Nuevos Fármacos Vencer las resistencias Genoma Nature 393, 537-544 (1998) Vacunas BIOINFORMATICA PROTEÓMICA GENÓMICA BIOLOGIA ESTRUCTURAL

8. ANTECEDENTES • Publicación del genóma de Mycobacterium tuberculosis Deciphering the biology of Mycobacterium tuberculosis from the complete genome sequence. S. T. Cole, y Col Nature 393, 537-544 (1998) • McKinney, Jy Col (2000) señalan que la latencia esta asociada a la expresión del gen para la isocitrato liasa que es esencial para el metabolismo de los ácidos grasos. Nature, 2000; 406: 735-38. • Glickman, M. Y Col (2000) encuentran una relación directa entre la latencia y la expresión de un gen involucrado en la síntesis de anillos de ciclopropano del ácido micólico. Mol. Cell., 2000; 5: 1-20.

9. OBJETIVOS - Hacer un inventario de las posibles dianas farmacológicas relacionadas al estado de latencia de Mycobacterium tuberculosis. - Evaluar la factibilidad de las posibles dianas farmacológicas en base al análisis del genóma del Mycobacterium tuberculosis. - Predecir y evaluar las estructuras tridimensionales de las posibles dianas farmacológicas usando herramientas bioinformáticas.

10. Análisis Genómico KEGG Biblioteca de Genes y Genómas Fasta output Regiones de otros genomas similares al gen de la posible Diana Fasta Z Fasta output Regiones del genóma de M tuberculosis similares al gen de la posible Diana TubercuList Web Server Secuencias de aminoácidos Fasta Z ACTCGTCGTCGTCAATCCCGACTCGTCGTCGTCAATCCCGGTACTTCGACGTCACTGCGTACTTCGACGTCACTGCACTCGTCGTCGTCAATCCCGGTACTTCGACGTCACTGCACTCGTCGTCGTCAATCCCGGTACTTCGACGTCACTGC ACTCGTCGTCGTCAATCCCGACTCGTCGTCGTCAATCCCGGTACTTCGACGTCACTGCGTACTTCGACGTCACTGCACTCGTCGTCGTCAATCCCGGTACTTCGACGTCACTGCACTCGTCGTCGTCAATCCCGGTACTTCGACGTCACTGC Entrez ACTCGTCGTCGTCAATCCCGACTCGTCGTCGTCAATCCCGGTACTTCGACGTCACTGCGTACTTCGACGTCACTGCACTCGTCGTCGTCAATCCCGGTACTTCGACGTCACTGCACTCGTCGTCGTCAATCCCGGTACTTCGACGTCACTGC ACTCGTCGTCGTCAATCCCGACTCGTCGTCGTCAATCCCGGTACTTCGACGTCACTGCGTACTTCGACGTCACTGCACTCGTCGTCGTCAATCCCGGTACTTCGACGTCACTGCACTCGTCGTCGTCAATCCCGGTACTTCGACGTCACTGC Predicción Estructura 3D Posibles Dianas Farmacológicas Módelado por Threading 3D Blast-P 3D-pssm NCBI SWISS-MODEL Medline Si/No Módelado por Homología Módelo 3D Información Bibliográfica METODOLOGIA

11. National Center for Biotechnology InformationU.S. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

12. KEGG: Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes http://www.kegg.com/

13. TubercuList World-Wide Web Server. Institut Pasteur, 1999-2001 http://genolist.pasteur.fr/TubercuList/

14. 3D-PSSM Protein Fold Recognition (Threading) Server http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~3dpssm/

15. elongación de ácidos grasos FASII DIANAS DE PARED GEN PROTEINA Acceso Estructura tridimensional Antagonista conocido Expresión/Función Biosíntesi de diaminopimelato dapB Dihidrodipicolinato reductasa NP_217289 Si Sulfonamidas crecimiento de la bacteria/capa de arabinogalactano wbbL ramnosil transferasa CAB07092 No No conocido D-manosa-1-fosfato guanidiltransferasa crecimiento de la bacteria/capa de arabinogalactano Rv3264c CAC30262 No No conocido AcpM ( acyl carrier protein del patógeno). Llevar los intermediarios de las enzimas del sistema FasII acpM NP_216760 Si Isoniazida InhA enoil-ACP reductasa NP_216000 Si Isoniazida beta-cetoacil-ACP sintasa CAA94641 Si Isoniazida, cerulenina y tiolactomicina Parte Operon sistema FAS II (elongar los productos de FAS I) KasB beta-cetoacil-ACP sintasa No NP_216762 cerulenina y tiolactomicina Parte Operon sistema FAS II (elongar los productos de FAS I) KasA pks2 Síntesis de ácidos grasos con múltiples ramificaciones de grupos metil No NP_218342 No conocido Se expresa en aquellas cepas de M.tuberculosis capaces de proliferar en macrófagos La síntesis de la pared/localización extracelular No conocido P31953 No conocido FBPB Antígeno 85B/micoliltransferasas P31952 Si Acido micolico ciclopropano sintasa (CMAS) CMAA2 Q11196 fbpC antígeno 85C/micoliltransferasas Si No conocido introducción de cis-ciclopropano en dos posiciones de la cadena alfa-alquil de los ácidos micólicos NP_855916 No mtfabD Si malonil CoA-ACP transacetilasa (MCAT). No conocido biosíntesis de ácidos grasos No conocido EmbA síntasa de la porción arabinán de la fracción de arabinogalactán P72060 No biosíntesis de la fracción galactán del complejo micolil-arabinogalactán biosíntesis de la fracción galactán del complejo micolil-arabinogalactán EmbB síntasa de la porción arabinán de la fracción de arabinogalactán NP_218312 No conocido No Etambutol Rv3808c(glft) UDP-galactofuranosiltransferasa CAA17872 umaA2 Síntetasa de ácdo micolicos NP_214984 Si No No conocido Esencial Esencial

16. GEN PROTEINA Acceso Estructura tridimensional Antagonista conocido Expresión/Función cluster génico narGHIJ (ej: NarG) Complejo nitrato reductasa NP_215677 No No conocido proteínas respiratorias/vías de respiración del nitrato hmp Dioxigenasa que cataliza la transformación del NO a nitrato NP_857241 No No conocido respuesta al estrés acr la alfa-cristalina AAM69206 No No conocido Condiciones Anaerobias / asociada al engrosamiento de la pared, estabilizando así la estructura celular aceA Isocitrato liasa (ICL) NP_336424 Si No conocido adaptación a las condiciones de microaerofilia/imprescindible para el mantenimiento del estado de latencia glcB Malato sintetasa CAB01465 Si No conocido KatG Catalasa-peroxidasa Q08129 No No conocido defensa antioxidante/oxida la Isoniazida DIANAS PROPIAS DEL ESTADO DE LATENCIA adaptación a las condiciones de microaerofilia

17. GEN PROTEINA Acceso Estructura tridimensional Antagonista conocido Expresión/Función Rv2276 citocromo P450 (monooxigenasa) Q59571 Si Miconidazol, Clotrimazol Degradación de ciertos compuestos xenobióticos NusA factor de trascripción (de elongación) CAB08449 Si No conocido Se une a la RNA polimerasa regulación transcripción rRNA. EfpA bomba de protones NP_217362 No No conocido Expresión es inducida en presencia de Isoniazida Fola Dihidrofolato reductasa O33305 Si No conocido Esencial para la síntesis de nucleótidos y varios aminoácidos (como met,ser ygly); quinol quinolonic-ácido ribosiltransferasa (QAPRTasa) No conocido enzima clave para la biosíntesis del NAD OTRAS POSIBLES DIANAS FARMACOLÓGICAS

18. RESULTADOS

19. Gen Segmentos de nucleótidos con similaridad Parametros Fasta Z Modelaje de estructura 3D Posición en la secuencía de aa Posición en le genóma de M tuberculosis Z-score E value 2278849-2278592 Modelaje comparativo acr 01--86 764.7 8.80E-41 26-61 101.8 0.00073 302485-302366 aceA Cristalografia 295-608 2161342-2162283 1637.8 2.00E-89 2160461-2161345 1-295 1512.5 1.90E-82 174-275 276 1.40E-13 2086979-2084757 Cristalografia 557972-558277 KatG 1-740 7142.9 0.00E+00 Hmp 1-358 4012414-4013487 1608.8 8.40E-88 glcB 1-741 7304.5 0.00E+00 2156109-2153890 narG 1-1232 1287326-1291021 Modelaje comparativo 17-357 3993707-3994732 274.4 1.80E-13 2231.8 1.70E-122 Modelaje comparativo 1-281 1964184-1963354 464 4.90E-24 Búsqueda de secuencias similares en el Genóma de Mycobacterium tuberculosis Threading 2 regiones Similares

20. Regiones en el genóma con alta similaridad

21. OUTPUT DEL THREADING 3D-PSSM Protein Fold Recognition (Threading) Server

22. PERSPECTIVAS

23. Análisis Genómico Presencia de secuencias Similares BUSQUEDA EN OTROS GENOMAS Fasta Z Bloques de secuencia Conservados Zonas de la estructura 3D Importantes Secuencias de aminoácidos ProDom Bases de Datos secundarias Sitio Activo ACTCGTCGTCGTCAATCCCGACTCGTCGTCGTCAATCCCGGTACTTCGACGTCACTGCGTACTTCGACGTCACTGCACTCGTCGTCGTCAATCCCGGTACTTCGACGTCACTGCACTCGTCGTCGTCAATCCCGGTACTTCGACGTCACTGC Chemoinformática ACTCGTCGTCGTCAATCCCGACTCGTCGTCGTCAATCCCGGTACTTCGACGTCACTGCGTACTTCGACGTCACTGCACTCGTCGTCGTCAATCCCGGTACTTCGACGTCACTGCACTCGTCGTCGTCAATCCCGGTACTTCGACGTCACTGC ACTCGTCGTCGTCAATCCCGACTCGTCGTCGTCAATCCCGGTACTTCGACGTCACTGCGTACTTCGACGTCACTGCACTCGTCGTCGTCAATCCCGGTACTTCGACGTCACTGCACTCGTCGTCGTCAATCCCGGTACTTCGACGTCACTGC Ensayos computacionalde Docking ACTCGTCGTCGTCAATCCCGACTCGTCGTCGTCAATCCCGGTACTTCGACGTCACTGCGTACTTCGACGTCACTGCACTCGTCGTCGTCAATCCCGGTACTTCGACGTCACTGCACTCGTCGTCGTCAATCCCGGTACTTCGACGTCACTGC Sculpt Módelo 3D Proteína • Información Cualitativa • Constante de acoplamineto Ki. Módelo 3D Ligandos Naturales AMBER Ligandos Sintéticos PubMed Modelaje molecular AB initio

24. FARMACOGENÓMICA Diseño de Drogas en Base a la Estructura tridimensional de la Diana farmacológica

25. CONCLUSIONES • Los genes aceA, glcB, NarG, acr, y KatG de Mycobacterium tuberculosis presentan secuencias de nucleótidos unicas en el genóma poco similares a otras regiones del mismo genoma. • El gen hmp presenta dos segmentos de nucleótidos altamente similares en el genoma de Mycobacterium tuberculosis H37Rv, (que posiblemente codifiquen isoenzimas capaces de catalizar la misma reacción, lo que dificultaría el hallar un inhibidor para esta actividad catalítica). • La disponibilidad de las estructuras tridimensionales obtenidas experimentalmente o por modelaje molecular comparativo de las proteínas seleccionadas como relacionados al estado de latencia, hace viable la obtención y evaluación computacional de ligandos (posibles farmacos) para estas proteínas.

26. Fundación Carolina • Este trabajo de Investigación se realiza gracias al apoyo y auspicio de las siguientes Instituciones: Facultad de Farmacía y Bioquímica Universidad Nacional Mayor de San Marcos La Fundación Carolina de España

27. Añay Biofaral@hotmail.com