600 likes | 869 Views
Drożdżowe systemy ekspresyjne. Dr inż. Marta Wanarska Katedra Mikrobiologii Wydział Chemiczny Politechnika Gdańska. Zastosowanie drożdżowych systemów ekspresyjnych. Produkcja białek wirusowych prokariotycznych eukariotycznych
E N D
Drożdżowe systemy ekspresyjne Dr inż. Marta Wanarska Katedra Mikrobiologii Wydział Chemiczny Politechnika Gdańska
Zastosowanie drożdżowych systemów ekspresyjnych • Produkcja białek • wirusowych • prokariotycznych • eukariotycznych których wytwarzanie na innej drodze jest trudne, niebezpieczne, ekonomicznie nieopłacalne • Produkcja metabolitów niebiałkowych • alkoholi • kwasów organicznych • cukrów z wykorzystaniem substratów odpadowych (serwatka, glicerol, hydrolizaty biomasy roślinnej)
Drożdżowe systemy ekspresyjne Charakterystyka drożdży jako gospodarzy ekspresyjnych • dobrze scharakteryzowane • łatwość przeprowadzenia manipulacji genetycznych • szybki wzrost i produkcja dużej ilości biomasy • wydajne systemy ekspresyjne • możliwość produkcji białek wewnątrz- i zewnątrzkomórkowo • trwałe rekombinanty – integracja plazmidów ekspresyjnych z genomem gospodarza • modyfikacje posttranslacyjne białek • tworzenie mostków disiarczkowych • N- i O-glikozylacja • przyłączanie kwasów tłuszczowych • proteolityczne dojrzewanie białek • możliwość produkcji białek fuzyjnych posiadających domeny ułatwiające oczyszczanie i detekcję białek lub zwiększające immunogenność
Drożdżowe systemy ekspresyjne Gatunki drożdży stosowane do produkcji heterologicznych białek • Saccharomyces cerevisiae • Pichia pastoris • Pichia methanolica • Hansenula polymorpha • Kluyveromyces lactis • Yarrowia lipolytica • Arxula adeninivorans • Schizosaccharomyces pombe
Saccharomyces cerevisiae • Niski poziom produkcji i sekrecji białek • Niestabilność plazmidów rekombinantowych • Hiperglikozylacja białek • Wąski zakres metabolizowanych źródeł węgla
Pichia pastoris i Hansenula polymorpha-podstawowa charakterystyka biochemiczna
Metabolizm metanolu 1 – oksydaza alkoholowa, 2 – katalaza, 3 – syntaza dihydroksyacetonu, 4 - dehydrogenaza formaldehydowa,5 – dehydrogenaza mrówczanowa, 6 - kinaza dihydroksyacetonu, 7- aldolaza fruktozo-1,6-bisfosforanu, 8 – fosfataza fruktozo- 1,6-bisfosforanu
Arxula adeninivorans – podstawowa charakterystyka biochemiczna • Źródła węgla i energii • szeroka gama cukrów, w tym skrobia • alkohole (z wyłączeniem metanolu) i diole • kwasy karboksylowe i dikarboksylowe • n-alkany • pierwszorzędowe alkiloaminy • Źródła azotu • jony amonowe • sole kwasu azotowego (V) • pierwszorzędowe alkiloaminy
Arxula adeninivorans – podstawowa charakterystyka biochemiczna • Termotolerancyjność zdolność do wzrostu w zakresie temperatury 30-48 °C • Temperaturozależny dimorfizm • wzrost w postaci pojedynczych pączkujących komórek w temp. do 42 °C • wzrost w postaci strzępek w temperaturze powyżej 42 °C • W postaci strzępek wykazuje wyższy poziom sekrecji białek • Różny wzór glikozylacji białek w zależności od formy morfologicznej • N-glikozylacja w obu typach komórek • O-glikozylacja tylko w pojedynczych komórkach
Formy morfologiczne Arxula adeninivorans A. adeninivorans LS3 hodowana w 30 °C A. adeninivorans LS3 hodowana w 45 °C
Yarrowia lipolytica – podstawowa charakterystyka biochemiczna • Źródła węgla i energii • glukoza • glicerol • etanol • octany • n-alkany • kwasy tłuszczowe • Źródła azotu • jony amonowe • Dimorfizm zależny od warunków środowiska tworzy strzępki w obecności N-acetyloglukozaminy jako jedynego źródła węgla w pożywce
Yarrowia lipolytica – podstawowa charakterystyka biochemiczna • W obecności n-alkanów wydziela kwas cytrynowy i izocytrynowy • W obecności n-alkanów i przy braku tiaminy wydziela α-ketoglutaran • Produkuje zewnątrzkomórkowo znaczne ilości białek • alkaliczna proteaza • kwaśna proteaza • RNA-za • kwaśna fosfataza • lipaza • esteraza • Optymalna temperatura wzrostu 30-34 °C
Drożdżowe systemy ekspresyjne • Szczepy gospodarzy ekspresyjnych • Wektory ekspresyjne • bakteryjne ori replikacji • bakteryjny marker selekcyjny • sekwencja umożliwiająca utrzymanie się wektora w komórce drożdży • drożdżowy marker selekcyjny • drożdżowy promotor i terminator transkrypcji AmpR PTEF1 Drożdżowy wektor ekspresyjny PHO5t ColE1 ori 25S rDNA URA3
Drożdżowe markery selekcyjne P. pastoris • geny oporności na antybiotyki • gen oporności na zeocynę • markery auksotroficzne • gen HIS4 P. pastoris lub S. cerevisiae • gen ARG4 S. cerevisiae • gen URA3 P. pastoris • gen ADE1 P. pastoris
Drożdżowe markery selekcyjne H. polymorpha • geny oporności na antybiotyki • gen oporności na zeocynę • gen oporności na pleomycynę • markery auksotroficzne • gen LEU 1.1 H. polymorpha • gen URA3 H. polymorpha • gen ADE11 H. polymorpha • gen LEU2 S. cerevisiae • gen URA3 S. cerevisiae • gen LEU2 C. albicans
Drożdżowe markery selekcyjne A. adeninivorans • geny oporności na antybiotyki • gen oporności na higromycynę B • markery auksotroficzne • gen LEU2 A. adeninivorans • gen TRP1 A. adeninivorans • gen TRP1 A. adeninivorans pod kontrolą krótkiego fragmentu promotora LEU2 A. adeninivorans
Drożdżowe markery selekcyjne Y. lipolytica • geny oporności na antybiotyki • gen oporności na pleomycynę • gen SUC2 S. cerevisiae • markery auksotroficzne • gen LEU2 Y. lipolytica • gen URA3 Y. lipolytica • gen ADE1Y. lipolytica
Sekwencje umożliwiające utrzymanie się wektora ekspresyjnego w komórce drożdży P. pastoris • Sekwencje umożliwiające rekombinację homologiczną z genomem drożdży • 5’ fragment promotora AOX1 • 5’ fragment promotora GAP • gen HIS4 P. pastoris A. adeninivorans • Sekwencje umożliwiające rekombinację homologiczną wektora z genomem drożdży • sekwencja kodująca 25S rRNA A. adeninivorans
Sekwencje umożliwiające utrzymanie się wektora ekspresyjnego w komórce drożdży H. polymorpha • Sekwencje umożliwiające rekombinację homologiczną wektora z genomem drożdży • gen MOX H. polymorpha • gen AMO H. polymorpha • gen LEU2 S. cerevisiae • gen URA3 S. cerevisiae • Sekwencje umożliwiające autonomiczną replikację wektora w komórkach drożdży • sekwencje ARS H. polymorpha
Sekwencje umożliwiające utrzymanie się wektora ekspresyjnego w komórce drożdży Y. lipolytica • Sekwencje umożliwiające rekombinację homologiczną wektora z genomem drożdży • terminator transkrypcji LEU2 • terminator transkrypcji URA3 • terminator transkrypcji XPR2 • sekwencje kodujące rRNA • sekwencje „zeta” (sekwencje LTR retrotranspozonu Ylt1) w szczepach niosących retrotranspozon Ylt1 • Sekwencje umożliwiające rekombinację niehomologiczną wektora z genomem drożdży • sekwencje „zeta” w szczepach nie niosących retrotranspozonu Ylt1 • Sekwencje umożliwiające autonomiczną replikację wektora w komórkach drożdży • sekwencje ARS Y. lipolytica
Zwiększenie poziomu sekrecji białek przez komórki drożdży Wprowadzenie do komórek drożdży dodatkowych genów kodujących białka opiekuńcze obecne w retikulum endoplazmatycznym • Foldazy • izomerazy disulfidowe • Białka opiekuńcze • kalneksyna • kalretikulina
Kierowanie białek do peroksysomów Peroksysomy • Zdolne do akumulacji dużej ilości białek • Nie zawierają enzymów modyfikujących białka • fosfokinaz • glikozylaz • proteaz Umożliwiają produkcję niezmodyfikowanych białek Sekwencja kierująca do peroksysomów -Ser-Lys-Leu-COOH peroksysomy H. polymorpha rosnąca w pożywce z metanolem
Produkcja termostabilnej β-D-galaktozydazy Pyrococcus woesei w systemie ekspresji Pichia pastoris
Przemysłowe zastosowanie β-D-galaktozydazy • Produkcja mleka o obniżonej zawartości laktozy • Produkcja dietetycznych przetworów mlecznych • Produkcja syropu glukozowo-galaktozowego • Produkcja bezlaktozowej serwatki • Synteza galaktooligosacharydów
Pyrococcus woeseiizolowany z morskiej solfatary (Porto di Levante, wyspa Volcano, Włochy) Domena: Archaea Grupa: Euryarchaeota Klasa: Thermococci Rząd: Thermococcales Rodzina: Thermococcaceae Rodzaj: Pyrococcus Gatunek: Pyrococcus woesei • Ziarniak • 0,8 - 2,0 μm • Urzęsienie lofotrichalne • Beztlenowiec • Optimum temperatury - 97 - 100°C • Optimum pH - 6,0 • Optimum NaCl - 30% • Produkty metabolizmu - H2, H2S (w obecności S0)
Konstrukcja systemu ekspresyjnego Pichia pastoris Kex2 pre-pro sekwencja α-faktora S. cerevisiae Lys-Arg β-D-galaktozydaza P. woesei
Produkcja β-D-galaktozydazy P. woeseiw systemie ekspresji P. pastoris (AOX1) Krzywa wzrostu P. pastoris GS115 + pPICZαβ-gal Indukcja ekspresji genu 24 – 47 h – 25% (m/v) glicerol + 5*10-4% biotyna + 0,05% histydyna (0,24 ml/min) 48 – 72 h – 25% (v/v) MeOH + 5*10-4% biotyna + 0,05% histydyna (0,24 ml/min) 72 – 144 h – 30% (v/v) MeOH + 5*10-4% biotyna + 0,05% histydyna (0,24 ml/min) Pożywka BMGY (2% pepton K, 1% ekstrakt drożdżowy, 0,1 M K2HPO4/KH2PO4 pH 6,0, 1,34% YNB, 4*10-5% biotyna, 2% glicerol), 30 °C, napowietrzanie 3,0 vvm, mieszanie 1200 obr./min, Biostat R, 5l (B. Braun Biotech International, Niemcy), 2,5 l objętości roboczej
Produkcja β-D-galaktozydazy P. woeseiw systemie ekspresji P. pastoris (AOX1) P. pastoris GS115 + pPICZαβ-gal M – Marker wielkości białek: 97, 66, 45, 30, 20,1 i 14,4 kDa 1 – pożywka hodowlana po 48 h hodowli 2 – pożywka hodowlana po 72 h hodowli 3 – pożywka hodowlana po 96 h hodowli 4 – pożywka hodowlana po 120 h hodowli 5 – pożywka hodowlana po 144 h hodowli Uzyskano 300 mg białka z litra pożywki pohodowlanej
Produkcja proteinazy K Tritirachium album w systemie ekspresji Pichia pastoris
Konstrukcja systemu ekspresyjnego Pichia pastoris • Zastosowanie proteinazy K Tritirachium album • izolacja genomowego DNA z komórek bakterii, drożdży itp. Kex2 pre-pro sekwencja proteinazy K T. album Lys-Arg proteinaza K T. album
Produkcja proteinazy K T. albumw systemie ekspresji P. pastoris (AOX1) 1 – Marker wielkości białek: 66, 45, 35, 25, 18,4 i 14,4 kDa 2 – pożywka hodowlana po 24 h indukcji (72 h hodowli) 3 – pożywka hodowlana po 48 h indukcji (96 h hodowli) 4 – pożywka hodowlana po 72 h indukcji (120 h hodowli) Uzyskano 700 mg białka z litra pożywki pohodowlanej P. pastoris GS115 + pPICZProtK
Porównanie wydajności produkcji białek w różnych drożdżowych systemach ekspresji
Produkcja interleukiny 6 (IL-6) Szczepy gospodarzy ekspresyjnych • Arxula adeninivorans • Hansenula polymorpha • Saccharomyces cerevisiae Rekombinantowy plazmid ekspresyjny
Produkcja interleukiny 6 (IL-6) A. adeninivorans pojedyncze komórki A. Adeninivorans strzępki H. polymorpha S. cerevisiae
Produkcja interleukiny 6 (IL-6) • A. adeninivorans; pojedyncze komórki – IL-6 stanowi 10% wydzielanych białek • A. adeninivorans; strzępki – IL-6 stanowi 30% wydzielanych białek • H. polymorpha -IL-6 stanowi 50% wydzielanych białek • S. cerevisiae - IL-6 stanowi 50% wydzielanych białek
Produkcja interleukiny 6 (IL-6) • A. adeninivorans; pojedyncze komórki • A. adeninivorans; strzępki • H. polymorpha • S. cerevisiae
Konstrukcja rekombinantowego szczepu Saccharomyces cerevisiae zdolnego do produkcji etanolu z laktozy zawartej w serwatce
Serwatkasurowiec do produkcji etanolu Serwatka - prawie klarowna ciecz powstała po ścięciu zawartej w mleku kazeiny • laktoza 4,5 - 5,0% m/v • białka 0,6 - 0,8% m/v • lipidy 0,4 - 0,5% m/v • sole mineralne, kwas mlekowy, kwas cytrynowy, mocznik, kwas moczowy Światowa produkcja serwatki – ponad 145 mln ton/rok
Zastosowanie serwatki 50% wytwarzanej na świecie serwatki jest przetwarzane