Drożdżowe systemy ekspresyjne

1. Drożdżowe systemy ekspresyjne Dr inż. Marta Wanarska Katedra Mikrobiologii Wydział Chemiczny Politechnika Gdańska

2. Zastosowanie drożdżowych systemów ekspresyjnych • Produkcja białek • wirusowych • prokariotycznych • eukariotycznych których wytwarzanie na innej drodze jest trudne, niebezpieczne, ekonomicznie nieopłacalne • Produkcja metabolitów niebiałkowych • alkoholi • kwasów organicznych • cukrów z wykorzystaniem substratów odpadowych (serwatka, glicerol, hydrolizaty biomasy roślinnej)

3. Drożdżowe systemy ekspresyjne Charakterystyka drożdży jako gospodarzy ekspresyjnych • dobrze scharakteryzowane • łatwość przeprowadzenia manipulacji genetycznych • szybki wzrost i produkcja dużej ilości biomasy • wydajne systemy ekspresyjne • możliwość produkcji białek wewnątrz- i zewnątrzkomórkowo • trwałe rekombinanty – integracja plazmidów ekspresyjnych z genomem gospodarza • modyfikacje posttranslacyjne białek • tworzenie mostków disiarczkowych • N- i O-glikozylacja • przyłączanie kwasów tłuszczowych • proteolityczne dojrzewanie białek • możliwość produkcji białek fuzyjnych posiadających domeny ułatwiające oczyszczanie i detekcję białek lub zwiększające immunogenność

4. Drożdżowe systemy ekspresyjne Gatunki drożdży stosowane do produkcji heterologicznych białek • Saccharomyces cerevisiae • Pichia pastoris • Pichia methanolica • Hansenula polymorpha • Kluyveromyces lactis • Yarrowia lipolytica • Arxula adeninivorans • Schizosaccharomyces pombe

5. Saccharomyces cerevisiae • Niski poziom produkcji i sekrecji białek • Niestabilność plazmidów rekombinantowych • Hiperglikozylacja białek • Wąski zakres metabolizowanych źródeł węgla

6. Pichia pastoris i Hansenula polymorpha-podstawowa charakterystyka biochemiczna

7. Metabolizm metanolu 1 – oksydaza alkoholowa, 2 – katalaza, 3 – syntaza dihydroksyacetonu, 4 - dehydrogenaza formaldehydowa,5 – dehydrogenaza mrówczanowa, 6 - kinaza dihydroksyacetonu, 7- aldolaza fruktozo-1,6-bisfosforanu, 8 – fosfataza fruktozo- 1,6-bisfosforanu

8. Arxula adeninivorans – podstawowa charakterystyka biochemiczna • Źródła węgla i energii • szeroka gama cukrów, w tym skrobia • alkohole (z wyłączeniem metanolu) i diole • kwasy karboksylowe i dikarboksylowe • n-alkany • pierwszorzędowe alkiloaminy • Źródła azotu • jony amonowe • sole kwasu azotowego (V) • pierwszorzędowe alkiloaminy

9. Arxula adeninivorans – podstawowa charakterystyka biochemiczna • Termotolerancyjność zdolność do wzrostu w zakresie temperatury 30-48 °C • Temperaturozależny dimorfizm • wzrost w postaci pojedynczych pączkujących komórek w temp. do 42 °C • wzrost w postaci strzępek w temperaturze powyżej 42 °C • W postaci strzępek wykazuje wyższy poziom sekrecji białek • Różny wzór glikozylacji białek w zależności od formy morfologicznej • N-glikozylacja w obu typach komórek • O-glikozylacja tylko w pojedynczych komórkach

10. Formy morfologiczne Arxula adeninivorans A. adeninivorans LS3 hodowana w 30 °C A. adeninivorans LS3 hodowana w 45 °C

11. Yarrowia lipolytica – podstawowa charakterystyka biochemiczna • Źródła węgla i energii • glukoza • glicerol • etanol • octany • n-alkany • kwasy tłuszczowe • Źródła azotu • jony amonowe • Dimorfizm zależny od warunków środowiska tworzy strzępki w obecności N-acetyloglukozaminy jako jedynego źródła węgla w pożywce

12. Yarrowia lipolytica – podstawowa charakterystyka biochemiczna • W obecności n-alkanów wydziela kwas cytrynowy i izocytrynowy • W obecności n-alkanów i przy braku tiaminy wydziela α-ketoglutaran • Produkuje zewnątrzkomórkowo znaczne ilości białek • alkaliczna proteaza • kwaśna proteaza • RNA-za • kwaśna fosfataza • lipaza • esteraza • Optymalna temperatura wzrostu 30-34 °C

13. Drożdżowe systemy ekspresyjne • Szczepy gospodarzy ekspresyjnych • Wektory ekspresyjne • bakteryjne ori replikacji • bakteryjny marker selekcyjny • sekwencja umożliwiająca utrzymanie się wektora w komórce drożdży • drożdżowy marker selekcyjny • drożdżowy promotor i terminator transkrypcji AmpR PTEF1 Drożdżowy wektor ekspresyjny PHO5t ColE1 ori 25S rDNA URA3

14. Szczepy ekspresyjne Pichia pastoris

15. Szczepy ekspresyjne Hansenula polymorpha

16. Szczepy ekspresyjne Arxula adeninivorans

17. Szczepy ekspresyjne Yarrowia lipolytica

18. Promotory transkrypcji P. pastoris

19. Promotory transkrypcji H. polymorpha

20. Promotory transkrypcji A. adeninivorans

21. Promotory transkrypcji Y. lipolytica

22. Drożdżowe markery selekcyjne

23. Sekwencje umożliwiające utrzymanie się wektora ekspresyjnego w komórce drożdży P. pastoris • Sekwencje umożliwiające rekombinację homologiczną z genomem drożdży • 5’ fragment promotora AOX1 • 5’ fragment promotora GAP • gen HIS4 P. pastoris A. adeninivorans • Sekwencje umożliwiające rekombinację homologiczną wektora z genomem drożdży • sekwencja kodująca 25S rRNA A. adeninivorans

24. Sekwencje umożliwiające utrzymanie się wektora ekspresyjnego w komórce drożdży H. polymorpha • Sekwencje umożliwiające rekombinację homologiczną wektora z genomem drożdży • gen MOX H. polymorpha • gen AMO H. polymorpha • gen LEU2 S. cerevisiae • gen URA3 S. cerevisiae • Sekwencje umożliwiające autonomiczną replikację wektora w komórkach drożdży • sekwencje ARS H. polymorpha

25. Sekwencje umożliwiające utrzymanie się wektora ekspresyjnego w komórce drożdży Y. lipolytica • Sekwencje umożliwiające rekombinację homologiczną wektora z genomem drożdży • terminator transkrypcji LEU2 • terminator transkrypcji URA3 • terminator transkrypcji XPR2 • sekwencje kodujące rRNA • sekwencje „zeta” (sekwencje LTR retrotranspozonu Ylt1) w szczepach niosących retrotranspozon Ylt1 • Sekwencje umożliwiające rekombinację niehomologiczną wektora z genomem drożdży • sekwencje „zeta” w szczepach nie niosących retrotranspozonu Ylt1 • Sekwencje umożliwiające autonomiczną replikację wektora w komórkach drożdży • sekwencje ARS Y. lipolytica

26. Zewnątrzkomórkowa produkcja białek

27. Zewnątrzkomórkowa produkcja białek

28. Zwiększenie poziomu sekrecji białek przez komórki drożdży Wprowadzenie do komórek drożdży dodatkowych genów kodujących białka opiekuńcze obecne w retikulum endoplazmatycznym • Foldazy • izomerazy disulfidowe • Białka opiekuńcze • kalneksyna • kalretikulina

29. Kierowanie białek do peroksysomów Peroksysomy • Zdolne do akumulacji dużej ilości białek • Nie zawierają enzymów modyfikujących białka • fosfokinaz • glikozylaz • proteaz Umożliwiają produkcję niezmodyfikowanych białek Sekwencja kierująca do peroksysomów -Ser-Lys-Leu-COOH peroksysomy H. polymorpha rosnąca w pożywce z metanolem

30. Produkcja białek w drożdżowych systemach ekspresji

31. Produkcja termostabilnej β-D-galaktozydazy Pyrococcus woesei w systemie ekspresji Pichia pastoris

32. Przemysłowe zastosowanie β-D-galaktozydazy • Produkcja mleka o obniżonej zawartości laktozy • Produkcja dietetycznych przetworów mlecznych • Produkcja syropu glukozowo-galaktozowego • Produkcja bezlaktozowej serwatki • Synteza galaktooligosacharydów

33. Pyrococcus woeseiizolowany z morskiej solfatary (Porto di Levante, wyspa Volcano, Włochy) Domena: Archaea Grupa: Euryarchaeota Klasa: Thermococci Rząd: Thermococcales Rodzina: Thermococcaceae Rodzaj: Pyrococcus Gatunek: Pyrococcus woesei • Ziarniak • 0,8 - 2,0 μm • Urzęsienie lofotrichalne • Beztlenowiec • Optimum temperatury - 97 - 100°C • Optimum pH - 6,0 • Optimum NaCl - 30% • Produkty metabolizmu - H2, H2S (w obecności S0)

34. Konstrukcja systemu ekspresyjnego Pichia pastoris Kex2 pre-pro sekwencja α-faktora S. cerevisiae Lys-Arg β-D-galaktozydaza P. woesei

35. Produkcja β-D-galaktozydazy P. woeseiw systemie ekspresji P. pastoris (GAP) Krzywa wzrostu P. pastoris GS115 + pGAPZαβ-gal 24 – 72 h – 40% (m/v) glukoza + 5*10-4% biotyna + 0,05% histydyna (0,24 ml/min) 72 – 120 h – 40% (m/v) glukoza + 5*10-4% biotyna + 0,05% histydyna (0,26 ml/min) 120 – 144 h – 40% (m/v) glukoza + 5*10-4% biotyna + 0,05% histydyna (0,27 ml/min) Pożywka YPD (2% pepton K, 1% ekstrakt drożdżowy, 2% glukoza), 30 °C, napowietrzanie 3,0 vvm, mieszanie 1200 obr./min, Biostat R, 5l (B. Braun Biotech International, Niemcy), 2,5 l objętości roboczej

36. Produkcja β-D-galaktozydazy P. woesei w systemie ekspresji P. pastoris (GAP) P. pastoris GS115 + pGAPZαβ-gal M – LMW SDS Marker: 97, 66, 45, 30, 20,1 i 14,4 kDa 1 – pożywka hodowlana po 24 h hodowli 2 – pożywka hodowlana po 48 h hodowli 3 – pożywka hodowlana po 72 h hodowli 4 – pożywka hodowlana po 96 h hodowli 5 – pożywka hodowlana po 120 h hodowli 6 – pożywka hodowlana po 144 h hodowli Uzyskano 300 mg białka z 1 litra pożywki pohodowlanej

37. Produkcja proteinazy K Tritirachium album w systemie ekspresji Pichia pastoris

38. Konstrukcja systemu ekspresyjnego Pichia pastoris • Zastosowanie proteinazy K Tritirachium album • izolacja genomowego DNA z komórek bakterii, drożdży itp. Kex2 pre-pro sekwencja proteinazy K T. album Lys-Arg proteinaza K T. album

39. Produkcja proteinazy K T. albumw systemie ekspresji P. pastoris (AOX1) Krzywa wzrostu P. pastoris GS115 + pPICZProtKKex2 Indukcja ekspresji genu 24 – 47 h – 25% (m/v) glicerol + 5*10-4% biotyna + 0,05% histydyna (0,24 ml/min) 48 – 72 h – 25% (v/v) MeOH + 5*10-4% biotyna + 0,05% histydyna (0,24 ml/min) 72 – 144 h – 30% (v/v) MeOH + 5*10-4% biotyna + 0,05% histydyna (0,24 ml/min) Pożywka BMGY (2% pepton K, 1% ekstrakt drożdżowy, 0,1 M K2HPO4/KH2PO4 pH 6,0, 1,34% YNB, 4*10-5% biotyna, 2% glicerol), 30 °C, napowietrzanie 3,0 vvm, mieszanie 1200 obr./min, Biostat R, 5l (B. Braun Biotech International, Niemcy), 2,5 l objętości roboczej

40. Produkcja proteinazy K T. albumw systemie ekspresji P. pastoris (AOX1) P. pastoris GS115 + pPICZProtKKex2 M – Marker wielkości białek: 170, 130, 100, 70, 55, 40, 35, 25, 15 i 10 kDa 1 – pożywka hodowlana po 48 h hodowli 2 – pożywka hodowlana po 72 h hodowli 3 – pożywka hodowlana po 96 h hodowli 4 – pożywka hodowlana po 120 h hodowli 5 – pożywka hodowlana po 144 h hodowli Uzyskano 700 mg białka z 1 litra pożywki pohodowlanej

41. Porównanie wydajności produkcji białek w różnych drożdżowych systemach ekspresji

42. Produkcja interleukiny 6 (IL-6) Szczepy gospodarzy ekspresyjnych • Arxula adeninivorans • Hansenula polymorpha • Saccharomyces cerevisiae Rekombinantowy plazmid ekspresyjny

43. Produkcja interleukiny 6 (IL-6) A. adeninivorans pojedyncze komórki A. Adeninivorans strzępki H. polymorpha S. cerevisiae

44. Produkcja interleukiny 6 (IL-6) • A. adeninivorans; pojedyncze komórki – IL-6 stanowi 10% wydzielanych białek • A. adeninivorans; strzępki – IL-6 stanowi 30% wydzielanych białek • H. polymorpha -IL-6 stanowi 50% wydzielanych białek • S. cerevisiae - IL-6 stanowi 50% wydzielanych białek

45. Produkcja interleukiny 6 (IL-6) • A. adeninivorans; pojedyncze komórki • A. adeninivorans; strzępki • H. polymorpha • S. cerevisiae

46. Konstrukcja rekombinantowego szczepu Saccharomyces cerevisiae zdolnego do produkcji etanolu z laktozy zawartej w serwatce

47. Serwatkasurowiec do produkcji etanolu Serwatka - prawie klarowna ciecz powstała po ścięciu zawartej w mleku kazeiny • laktoza 4,5 - 5,0% m/v • białka 0,6 - 0,8% m/v • lipidy 0,4 - 0,5% m/v • sole mineralne, kwas mlekowy, kwas cytrynowy, mocznik, kwas moczowy Światowa produkcja serwatki – ponad 145 mln ton/rok

48. Zastosowanie serwatki 50% wytwarzanej na świecie serwatki jest przetwarzane

49. Serwatkasurowiec do produkcji etanolu Najwięksi światowi producenci etanolu z serwatki • Anchor Ethanol Company, Nowa Zelandia (17-21 mln l/rok) • Golden Cheese Company of California, USA • Cerbery Ballineen Company, Irlandia Wykorzystywane szczepy – Kluyveromycesfragilis • bezpośrednia fermentacja laktozy z wytworzeniem etanolu • wrażliwość na wysokie stężenie etanolu w płynie hodowlanym • wrażliwość na wysokie stężenie sacharydów w płynie hodowlanym Wydajność produkcji – 4% etanolu w płynie pohodowlanym

50. Etanol jako składnik biopaliw Biopaliwa - benzyny silnikowe zawierające powyżej 5,0% objętościowo biokomponentów lub powyżej 15,0% objętościowo eterów • bioetanolu • eteru etylo-tert-butylowego Wykorzystanie biopaliw w Polsce w 2010 r. • biokomponenty – 5,75% wartości enetgetycznej paliw transportowych Wykorzystanie biopaliw w Polsce w 2013 r. • biokomponenty – 7,10% wartości energetycznej paliw transportowych