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欢迎生技同学学习 生物化学实验（一）. 2010.9. 实验一、生物化学实验技术简介. 1 　生化 实验目的. 掌握蛋白质、酶、核酸、糖等重要物质的分离、纯化和测定技术的原理及方法； 掌握生物化学的基本知识、基本理论及基本实验 技能 ； 培养分析和解决问题能力以及严谨细致的科学作风、创新能力等综合素质。. 2 通过生物化学实验应该做到. 学习设计一个实验的基本思路，掌握各个实验的基本原理，学会严密地组织自己的实验， 合理地安排实验步骤和时间 。 训练实验的动手能力，学会熟练地使用各种生物化学 实验仪器 。

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  1. 欢迎生技同学学习 生物化学实验（一） 2010.9

  2. 实验一、生物化学实验技术简介

  3. 1　生化实验目的 • 掌握蛋白质、酶、核酸、糖等重要物质的分离、纯化和测定技术的原理及方法； • 掌握生物化学的基本知识、基本理论及基本实验技能； • 培养分析和解决问题能力以及严谨细致的科学作风、创新能力等综合素质。

  4. 2 通过生物化学实验应该做到 • 学习设计一个实验的基本思路，掌握各个实验的基本原理，学会严密地组织自己的实验，合理地安排实验步骤和时间。 • 训练实验的动手能力，学会熟练地使用各种生物化学实验仪器。 • 学会准确翔实地记录实验现象和数据的技能，提高实验报告的写作能力，能够整齐清洁地进行所有的实验。 • 掌握生物化学的各种基本实验方法和实验技术，为今后参加科研工作打下坚实的基础。

  5. 3 生物化学实验技术发展简史 该学科的发展与实验技术的发展密切相关，每一种新的生化物质的发现与研究都离不开实验技术，实验技术每一次新的发明都大大推动了生物化学研究的进展，因而对于每一位现代生物科学工作者，尤其是生物化学工作者，学习并掌握各种生物化学实验技术就是极为重要的。 • 生物化学的发展大体可分为3个阶段 • 静态的描述性阶段、动态生化阶段、生物大分子结构功能研究阶段

  6. 4 实验准备4.1预习实验 • 熟悉本次实验的目的、原理、操作步骤，懂得每一操作步骤的意义和了解所用仪器的使用方法，否则不能开始实验。每次实验前需写好预习报告。

  7. 4.2 仪器的清洗（P281） 玻璃仪器→用洗洁精或洗衣粉（有时需用废乙醇等有机溶剂）洗→用自来水冲洗→用少量蒸馏水荡洗→自然风干或放入低温干燥 比色皿→用自来水冲洗（必要时放入洗洁精等）→用蒸馏水冲洗→放入有酒精的烧杯中泡一宿（去除有机物）→用清水冲干净→蒸馏水荡洗→倒扣在纸上晾干备用

  8. 5 玻璃仪器的使用

  9. 6 离心机

  10. 6.1 离心事故 • 离心机转头损坏的原因 （操作或使用不当所造成的） • 过速 • 不平衡 • 腐蚀 • 金属疲劳

  11. 6.2 离心设备 • 依转速大小分为：小于6000rpm的低速离心机、小于25000rpm的高速离心机、超过30000rpm的超速离心机等。 • 依用途分为：分析离心机、制备离心机 • 依用途还可分为：冷冻离心机、非冷冻离心机

  12. 6.3 离心机相关基本概念 • 原理：利用转头旋转产生的离心惯性力，把物理性质（如质量、浮力、沉降系数等）不同的悬浮液内微粒进行分离。 • 转速RPM 转/分 • 离心机的最高转速 • 转头的最高转速 • 转头的最高允许转速 • 转头的允许转速

  13. 离心力和相对离心力 • 离心力=粒子质量×离心加速度 （F离心力=m×r ω2） ω指角速度（弧度/秒，rad/s） 相对离心力RCF= F离心力/F重力= r ω2/g • g≈980 cm/s2 • 低速离心机常以n转速表示，高速离心机常以RCF表示。RCF与转速之间的互换常以列线计算图（RCF n r）来求出。有的离心机上同时显示n 和 RCF

  14. 沉降系数S：单位离以力作用下颗粒的沉降速度。沉降系数S：单位离以力作用下颗粒的沉降速度。 • 沉降速度ν：在离心作用下单位时间内运动的距离。 • 分离时间t：待分离颗粒在悬浮液中形成沉淀所需要的时间。最高转速下t=K/S • 非最高转速下t=K*(最高离心速度/所需离心速度）^2/S • K为K因子，离心机在最高转速时每个转头的离心效力，与最大最小直径为关。

  15. 6.4 离心机的操作规程（安亭） • 插上电源，待机指示灯亮，打开电源开关，同时可开启盖门，超过5秒钟，电子门锁又自动锁门，若要开启盖门，必须按面板上的电源开关的关键，再按开键，5秒钟内用手开启盖门，调速与定时系统的数码管显示的闪烁数字为机器工作转速的出厂设定，温控系统的数码管显示此时离心腔的温度 • 将样品等量放置在试管内,并将其对称放入转头 • 拧紧转轴螺母,盖好盖门 • 设定温度：按功能键 ，显示离心机上限工作温度出厂设定，此时可用◀键和▲或▼键相结合调整该参数至需要的值，按功能键 ，显示离心机下限工作温度出厂设定，此时可用◀键和▲或▼键相结合调整该参数至需要的值，再按一次功能键，数码管即显示离心腔的温度，此时若按“T”键，温控仪将按照设定的工作温度自行控制压缩机的运行 • 注：设定温度时，上限设定值必须大于下限设定值2℃,否则，温控仪就以2℃作为上下限温度的实际差值 • 设定运转速度和运转时间：可按功能键 ，显示CD00，按◀键和▲或▼键使显示为CD47，再按功能键 ，显示离心机的工作转速的出厂设定，按◀键和▲或▼键，使显示为所需的转速频率，按 将设定值存储设定完毕,呈现待机状态,再按功能键, 显示CD00，按◀键和▲或▼键使显示为CD59，再按功能键 ，显示离心机的工作时间的出厂设定，按◀键和▲或▼键，使显示为所需的运转时间，按 将设定值存储设定完毕,呈现待机状态 • 注:转速=频率*60 仪器上显示的是频率 • 设定时间时,数码管显示0.20表示运转时间为20分钟,显示1.20表示运转时间为1 小时20 分钟, • 离心机一次运行最好不要超过60min • 按运转键 启动仪器 • 运转结束,按控制面板上的停止键,数码管显示dcdt,同时可以打开盖门，如3秒内未把门打开，必须按面板上的电源开关的关键，再按开键，5秒钟内用手开启盖门,数秒钟后,显示闪烁转速值,这时机器已准备好下一次工作.

  16. 6.5 离心机和转头保养注意事项 • 清洁离心机腔体和转头，并擦干腔内冷凝水 • 使用完后要打开门，直至腔内恢复常温 • 离心之前要平衡样品：使用电子天平或托盘天平 • 根据需要选用tubes/bottles、adapters 以及spacers，根据要求加样品量 • 必要时预冷转子 • 使用前一定要阅读说明书或操作规程

  17. 7 分光光度计7.1 原理 光线的本质是电磁波的一种，有不同的波长。肉眼可见的彩色光称为可见光，波长范围在400～750nm：小于400nm的光线称为紫外光；大于750nm的光线称为红外光。 • 当光线通过透明溶液介质时，其辐射的波长有一部分被吸收，一部分透过、因此光线射出溶液之后，部分光波减少，这种光波的吸收和透过可用于某些物质的定性定量分析。 • I0= Ia+ It+ Ir I0= Ia+ It • 入射光强度为I0，吸收光强度为Ia,透射光强度为 It，反射光强度为Ir

  18. 7.2 概念 • 透光度：透光度为透过光的强度It与入射光强度I0之比，用T表示： • 即 T= It/I0 • 吸光度: 为透光度倒数的对数，用A表示 • 即 A=lg(1/T)=lg(I0/It)=-lgT

  19. 朗伯-比尔定律：当一束平行单色光通过含有吸光物质的稀溶液时，溶液的吸光度与吸光物质浓度、液层厚度乘积成正比，即朗伯-比尔定律：当一束平行单色光通过含有吸光物质的稀溶液时，溶液的吸光度与吸光物质浓度、液层厚度乘积成正比，即 • A= κ cl • 式中比例常数κ与吸光物质的本性，入射光波长及温度等因素有关。c为吸光物质浓度，l为透光液层厚度。

  20. 7.3 紫外可见分光光度计类型 按波长范围划分： 可见分光光度计（400-780nm） 紫外可见分光光度计(200-1000nm) 按光路划分： 单光束分光光度计 双光束分光光度计 双波长分光光度计

  21. 光路 单光束分光光度计 双波长分光光度计 双光束分光光度计

  22. 光源 单色器 吸收池 检测器 信号显示系统 7.4 组 成 结 构

  23. 1 光源 在紫外可见分光光度计中，常用的光源有两类：热辐射光源和气体放电光源 热辐射光源用于可见光区，如钨灯和卤钨灯；气体放电光源用于紫外光区，如氢灯和氘灯。要求：在整个紫外光区或可见光谱区可以发射连续光谱， 具有足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命。 紫外---氘灯(185-375 nm) 可见---钨灯(320-1000nm)

  24. 聚光镜 反射镜 狭缝 准直镜 聚狭缝 光栅 2 单色器 单色器的主要组成：入射狭缝、出射狭缝、色散元件和准直镜等部分。单色器质量的优劣，主要决定于色散元件的质量。色散元件常用棱镜和光栅。

  25. 3 吸收池 吸收池又称比色皿或比色杯，按材料可分为玻璃吸收池和石英吸收池（标Q和S的都是石英的），前者不能用于紫外区，因其在紫外吸收一些光。吸收池的种类很多，其光径可在0.1~10cm之间，其中以1cm光径吸收池最为常用。 注意事项：手执两侧的毛面，盛放液体高度四分之三。

  26. 4 检测器 检测器的作用是检测光信号，并将光信号转变为电信号。现今使用的分光光度计大多采用光电管或光电倍增管作为检测器。 5 信号显示系统 常用的信号显示装置有直读检流计，电位调节指零装置，以及自动记录和数字显示装置等。

  27. 7.5 波长的选择 • 由于溶液对光的选择性吸收引起的，溶液呈现的是被吸收物质的互补色。可通过测定溶液的吸收光谱曲线，找到最大吸收峰及较适合的波长。

  28. 7.6 操作规程 • 开启电源：预热30min • 用“功能”键设置测试方式：透射比（T）、吸光度（A） • 注：如要测浓度（C）或斜率（F）时，测试方式在此调为A • 用波长选择旋钮设置您所需的分析波长 • 注：波长改变需调仪器的0%，调节方法为：将0%T校具（黑体）置入光路中，盖上样品室盖，按“功能”键，将测试模式转换在T方式下，按“0%T”键，此时显示器显示“000.0”T后取出黑体 • 将您的参比样品溶液和被测样品溶液分别倒入比色皿中，样品液面高度大于25mm • 打开样品室盖，将盛有溶液的比色皿分别插入比色皿槽中，再盖上样品室盖 • 注：比色皿透光部分表面不能有指印、溶液痕迹，被测溶液中不能有气泡、悬浮物，否则影响样品测试的精度 • 将参比样品推（拉）入光路中，盖上样品室盖，按“OABS/100%T”此时显示器显示由“BLA”到“100.0%T”或“0.000A”为止，调功能键为所需的T、A、C、F • 注：如果测C，需将标准样品推或拉入光路中，按“上升”或“下降”键，将已知样品的浓度值输入仪器，直至显示器显示您所需的样品浓度值，按“确认”键 • 如果已知样品的斜率F时，需将标准样品推或拉入光路中，按“上升”或“下降”键，将已知样品的斜率值输入仪器，直至显示器显示您所需的样品斜率值，按“确认”键，此时指示灯自动指向C • 将被测样品推或拉入光路中，这时，可从显示器上得到被测样品的透射比值或吸光度值或浓度值 • 结束后，关闭仪器电源开关，切断电源 • 性能指标：波长精度：±2.0nm 波长重复性：≤1nm 波长范围：325～1000nm • 透射比准确度：±1%T 光度范围 0-100%T -0.097-2.000A 0-1999C • 光源：钨卤素灯 6V/10W

  29. 7.7 标准曲线的制定 • 先配制一系列已知不同浓度的测定物溶液，按测定管同样方法处理显色，分别读取各管吸光度，以各管吸光度为横座标，各管深夜浓度为纵座标，在Excell上作图得标准曲线。 • 一般认为，标准曲线范围在测定物浓度的一半到二倍之间，并使吸光度在0.05~1.0范围内为宜。所作标准曲线仅供短期使用。 • 标准曲线制定和物质浓度测定应尽量在同一台仪器上操作，因为即使是同样型号的仪器，因不是同一台仪器，结果也存在误差。

  30. 比色皿的校核 • 将两只石英比色皿编号标记，装入蒸馏水，在一定吸收波长处比较两只比色皿的透光率。以透光率最大的比色皿为100﹪透光，测定另一只比色皿的透光率，换算成吸光度作为它的校正值。测定溶液时，以那只透光率最大的比色皿作空白，另一只比色皿装待测溶液，测定的吸光度减去其校正值。

  31. 下学期要涉及的仪器

  32. 电泳装置 • 主要用于分析、鉴定，也可用于制备。电泳装置由电源和电泳槽两部分组成.

  33. 层析装置 • 主要的层析技术有：吸附层析、凝胶排阻层析、离子交换层析和亲和层析等。

  34. 8 本学期实验安排 实验学时数：32学时 1）生物化学实验技术简介 2）鸡蛋清中蛋白质的颜色反应及分别利用双缩脲法、考马斯亮蓝法测定其蛋白质浓度 3）蛋白质的沉淀反应 4）酵母RNA的提取RNA的定量测定 5）植物组织中总糖和还原性糖含量的测定 6）酵母醇脱氢酶的提纯 7）实验考查（生化实验一）

  35. 9 实验记录与实验报告 • 实验前写好实验预习报告(钢笔和园珠笔)。 • 实验中应及时准确地记录(事先在记录纸上设计好各种记录格式和表格）所观察到的现象和测量的数据。 • 实验记录要注意有效数字，如吸光度值应为“0.050”，而不能记成“0.05”。每个结果都要尽可能重复观测二次以上，即使观测的数据相同或偏差很大，也都应如实记录，不得涂改。

  36. 实验报告的格式应为： ⑴ 实验目的； 　　⑵ 实验原理； 　　⑶ 仪器、材料和试剂； 　　⑷ 实验步骤； 　　⑸ 结果讨论（含数理据处）； 　　⑹ 注意事项; (7) 思考题 注意：实验结果的讨论要充分，尽可能多查阅一些有关的文献和教科书，充分运用己学过的知识和生物化学原理，进行深入的探讨，勇于提出自己独到的分析和见解，并欢迎对实验提出改进意见。

  37. 10 考核方法 实验过程表现成绩、实验报告成绩，各占50%，占生化实验（一）总成绩的60%。 • 实验过程表现成绩：包括学习态度是否认真、实验预习、课堂回答问题情况、实验操作是否正确规范、实验结果是否正确、是否具有创新意识、打扫卫生等方面。 • 实验报告成绩：包括实验报告的格式是否正确、原理是否论述清楚、实验结果分析讨论是否符合逻辑，报告字迹是否清楚等方面。 实验考查成绩：占总实验成绩40%

  38. 11、其它要求 • 按时上课，不能迟到； • 做实验看好自己的仪器设备，不去动其它组的仪器设备，保持整洁； • 实验时注意安全； • 使用仪器时要注意操作规程，用完需清理仪器并在使用记录本上登记； • 实验做完，需要老师在原始数据处签字，清洗好仪器，整理好桌面后方可离开； • 按时交实验报告，周四、周一。 • 值日生：清理用过的仪器，包括天平、分光光度计、离心机等；清理桌面；清理地面；擦黑板；倒垃圾。

  39. 12 实验操作 1)依下表配制溶液 2）在600nm处测定吸收值 3）作标准曲线 4）清理仪器设备

  40. 作业 • 标准曲线 • 看生化实验书P279-294 • 写实验报告 • 预习实验29、30、32

  41. 实验二、蛋白质的颜色反应及含量测定

  42. 一、实验目的 • 1.1、了解构成蛋白质的基本结构单位及主要连接方式。 • 1.2、了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理。 • 1.3、学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法。 • 1.4、学习考马斯亮蓝法、双缩脲法测定蛋白质浓度的原理和方法

  43. 实验三、蛋白质的沉淀反应

  44. 1、实验目的 • 熟悉蛋白质的沉淀反应 • 进一步掌握蛋白质的性质

  45. 2、实验难点与重点 • 2.1蛋白质沉淀的方法有哪些 • 2.2蛋白质沉淀反应的原理

  46. 3、实验原理 • 蛋白质胶体溶液稳定的因素:水化膜、表面电荷 • 加入适当试剂使蛋白质分子处于等电点状态或失去水化层，或者与某些试剂结合成不解的盐后，蛋白质的胶体溶液就不稳定，并将产生沉淀。

  47. 改变蛋白质表面的水化层及电荷的主要途径有：改变蛋白质表面的水化层及电荷的主要途径有： • 改变溶液的离子强度 • 改变溶液的pH • 改变溶液的介电常数 • 改变溶液的温度 • 蛋白质沉淀可逆与不可逆的区别

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