Présenté par Olivier DELORME

1. Étude de la régulation des protéines Rho3 et Rho4:recherche des kinases responsables de la phosphorylation de la RhoGAP Rgd1 chez la levure Saccharomyces cerevisiae Présenté par Olivier DELORME Sous la direction de MM. François DOIGNON et Didier THORAVAL Laboratoire de Biologie Moléculaire et Séquençage, IBGC, UMR CNRS 5095/Université Victor Segalen Bordeaux 2

2. Forme inactive Rho3/4 Pi GDP GDP GEF Rgd1 Rho3/4 GTP GTP Forme active Le cycle de régulation des protéines Rho3 et Rho4

3. FCH RhoGAP Rho GTPase Activating Protein  Fes-CIP4 Homology Coiled-coil D’après Roumanie et al., 2000 La protéine Rgd1 (Related GAP Domain 1)

4. H. Fernandes.2005 La protéine Rgd1 est phosphorylée

5. ? ? S336 Où se trouvent les sites de phosphorylation ?

6. La phosphorylation régule l’activité de Rgd1p H. Fernandes. 2005 L’activité RhoGAP augmente lorsque Rgd1 est sous forme non phosphorylée

7. Quels sont les mécanismes qui régulent Rgd1p ? Phosphatases? Rho3 Rgd1 Rho4 Kinases?

8. Objectifs Participation à l’étude de la régulation des protéines Rho3 et Rho4 Etude de la régulation de Rgd1p Recherche des kinases

9. Recherche des kinases de Rgd1p • Approche ciblée : • Analyse des souches mutées pour les gènes codant pour les kinases potentielles de Rgd1p • Approche globale: • Analyse des souches mutées pour les gènes codant pour les kinases • Approche par la protéomique : le Proto-Array

10. Approche ciblée : les kinases potentielles Rgd1p Mkk2p Bck1p Mkk2p et Bck1p Complexe protéique Activité AMPc dépendante, la quantité d’AMPc varie au cours de la croissance PKA (Tpk1, Tpk2, Tpk3) Ipl1 Aurora B ? Ipl1p MgcRacGAPp GAP GAP Rgd1p

11. Détection et Quantification par caméra CCD Acquisition d’une image Acquisition des valeurs d’intensité des bandes Prélèvement des cellules Extraction Protéines totales Calculs des rapports P/nP pour chaque extrait et détermination du seuil Détection des bandes présentes sur la membrane Western Blot Stratégie d’analyse

12. WT 1Δ 2Δ 3Δ 4Δ 5Δ 6Δ rgd1Δ P nP P/nP P/nP P/nP P/nP P/nP P/nP P/nP P/nP P/nP P/nP P/nP Moyenne P/nP Ecart-type Seuil=(moyenne)-(écart-type) P/nP<Seuil => la souche est sélectionnée Méthode de calcul

13. Approche Ciblée Valeur P/nP 3,3 3 2,9 2,5 2,4 2,2 2,1 1,9 Seuil 1,8 1,7 Extraits protéiques 1,2 1 tpk1Δ, tpk2Δ, tpk3Δ WT WT WT WT WT mkk2Δ bck1Δ ipl1-322 ipl1-322

14. Valeur P/nP 6,5 3 2,5 2 1,5 Seuil 1 WT1 WT3 WT5 ypk2Δ ste7Δ ssk1Δ yil042cΔ ynr047wΔ yck2Δ yak1Δ ypk1Δ ypl236cΔ ydl025cΔ Extraits protéiques ygr052cΔ ymr291wΔ rgd1Δ WT2 ssk1Δ WT4 Approche globale

15. Approche globale

16. Quelles sont les kinases retenues? Endocytose, cytocinèse Yck1p, Yck2p Mécanismes du cycle cellulaire Bub1p, Fus3p, Pho85p Sélection du site de bourgeonnement Bud32p Dig1p, Tpk3p Croissance invasive Régulation de l’ARN polymérase II Ssn8p Régulation des mécanismes de réparation de l’ADN Mck1p, Dun1p

17. L’analyse des souches mutées par Western Blot est elle suffisante ? • Le crible permet de sélectionner les kinases candidates • Il est impossible de déterminer les kinases qui interagissent physiquement avec Rgd1p

18. V5 6xHis Rgd1 Recherche des kinases en utilisant le proto-array Protéine de fusion purifiée Utilisation Anticorps Anti-V5 fluorescent Incubation des protéines de fusion sur la puce Localisation des protéines qui interagissent avec Rgd1p Puce Invitrogen™  contenant 4088 protéines de S. cerevisiæ (70% des protéines totales)

19. Comment obtenir la protéine de fusion ? Amplification de la séquence codante de RGD1 Clonage du produit de PCR dans un vecteur navette Transformation de bactérie avec le vecteur contenant la séquence codante Production du vecteur dans la bactérie, puis transformation des levures avec le vecteur Purification de la protéine de fusion

20. Le vecteur utilisé pour effectuer la construction Invitrogen

21. Conclusions générales • Le crible des kinases ciblées a permis de sélectionner Ipl1 • A partir des 140 protéines testées, 11 kinases ont été retenues. Parmi ces 11 kinases Yck1, Yck2, Bud1 et Fus3 sont les meilleures candidates • La construction plasmidique contenant la séquence codante fusionnée aux étiquettes V5 et 6xHis a été effectuée

22. Perspectives • A court terme : • Terminer l’approche par le proto-array • Effectuer des tests d’activité sur les 11 kinases retenues • A long terme : • Étudier les kinases et leur implication dans la régulation des protéines Rho3 et Rho4 • Effectuer les cribles pour rechercher les phosphatases de la protéine Rgd1

23. Merci de votre attention Laboratoire de Biologie Moléculaire et Séquençage, IBGC, UMR CNRS 5095/Université Victor Segalen Bordeaux 2