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In realtà gli spettri di standard e campione non sono identici Si usa l’integrale spettrale

In realtà gli spettri di standard e campione non sono identici Si usa l’integrale spettrale L’integrale va calcolato in l !. Osservabili: spettro di emissione.  ecc. fissa.  em. variabile. F in funzione di  em. Rilassamento del solvente. S 1. S 1 ’. E. Em. Ass. h n. h n.

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In realtà gli spettri di standard e campione non sono identici Si usa l’integrale spettrale

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Presentation Transcript

  1. In realtà gli spettri di standard e campione non sono identici • Si usa l’integrale spettrale • L’integrale va calcolato in l!

  2. Osservabili: spettro di emissione • ecc. fissa. • em. variabile. • F in funzione di em..

  3. Rilassamento del solvente S1 S1’ E Em. Ass. hn hn S0’ S0

  4. c-Hex DMF EtOH H2O Rilassamento del solvente d = 10 Debye d = 2.8 Debye 6-propionil-2-(N,N-dimetilammino)naftalene (PRODAN)

  5. Rilassamento del solvente 4-dimetilammino-4'-nitrostilbene(DNS) H, hexane; CH, cyclohexane; T, toluene; EA, ethylacetate; Bu, n-butanol.

  6. Denaturazione proteica The use of fluorescence methods to monitor unfolding transitions in proteins. Biophys. J. 1994 66: 482.

  7. Partizione acqua-membrana Orioni et al., BBA 2009. KP

  8. Transizioni di fase in membrana

  9. Transizioni di fase in membrana Bocchinfuso et al., J. Pept. Sci., 2009 Biophys. J. 2000, 78: 290

  10. Red-edgeexcitation Eccezione alla regola di Kasha!

  11. Red-edgeexcitation

  12. Segnale di fondo:diffusione elastica ed anelastica della luce

  13. Perché vediamo la luce del laser anche osservando a 90°?

  14. ScatteringRayleigh È una diffusione elastica. L’energia e la lunghezza d’onda della radiazione vengono conservate.

  15. Visione classica Visione quantistica • Il dipolo indotto oscilla alla stessa frequenza del campo applicato. • Un dipolo oscillante emette radiazione. • La molecola emette radiazione della stessa frequenza di quella incidente.

  16. Normalmente la diffusione elastica non crea problemi perché è alla lunghezza d’onda di eccitazione (mentre la fluorescenza è a lunghezze d’onda maggiori). • E’ dovuta essenzialmente al solvente (Csolvente>>Csoluto). Si può sottrarre misurando uno spettro del solo solvente.

  17. Diffusione Raman (anelastica)

  18. Stokes ed anti-Stokes A T ambiente normalmente la linea anti-Stokes non si vede.

  19. Visione classica Se la molecola vibra, con frequenza wm, la sua polarizzabilità cambierà con la stessa frequenza. • Il dipolo oscillante emetterà a wp, wp-wm,, wp+wm.

  20. L’energia persa dipende dai livelli vibrazionali della molecola coinvolta.

  21. La differenza in energia (non l) tra luce incidente e diffusa è costante.

  22. Raman e fluorescenza • Come la fluorescenza è a lunghezzed’ondamaggioridell’eccitazione • A differenzadellafluorescenzasisposta al variaredellalunghezzad’onda di eccitazione. • Puòesserespostata a lunghezzed’onda diverse daquelle di emissionecambiandolunghezzad’onda di eccitazione. • È dovutaessenzialmente al solvente e puòesseresottratta.

  23. Osservabili: spettro di eccitazione • em. fissa. • ecc. variabile. • F in funzione di ecc.. • Se: • unico fluoroforo • F indipendente da ecc. • (unico stato eccitato). • A<<1 • Allora F(ecc.) A(ecc.) • Altrimenti: separazione dei diversi cromofori

  24. Excitation spectra exc=variable, em= fixed exc=510 nm em=525 nm em=540 nm exc=480 nm

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