Schema di uno spettrometro di massa

1. Schema di uno spettrometro di massa Computer Segnale Sistema di introduzione Sorgente di ioni Analizzatore di massa Rivelatore Campione Ioni Ioni 10-5-10-8 torr Campione Sistema di vuoto

2. Schema di uno spettrometro di massa Computer Segnale Sistema di introduzione Sorgente di ioni Analizzatore di massa Rivelatore Campione Ioni Ioni 10-5-10-8 torr Campione Sistema di vuoto

3. Sorgenti ioniche Stato del campione Sorgente Gassoso Ionizzazione elettronica (EI) Ionizzazione chimica (CI) Liquido Elettrospray – nanospray APCI (atmospheric pressure chemical ionization) APPI (atmospheric pressure photoionization) Liquido/solido Sorgenti a deplezione/ionizzazione (FAB, MALDI, SIMS)

4. Interfacciamento GC/MS Stato del campione Sorgente Gassoso Ionizzazione elettronica (EI) Ionizzazione chimica (CI) Queste sorgenti sono adatte all’interfacciamento con la gascromatografia, purché il flusso di fase mobile sia compatibile con la MS GC con colonne impaccate: ~ 20 cm3 min-1 GC con colonne capillari: ~ 1 cm3 min-1 (accettabile per la MS)

5. Classificazione delle sorgenti ioniche • Sorgenti “dure” (elevata frammentazione) • Ionizzazione elettronica • Sorgenti “molli” (bassa frammentazione) • Ionizzazione chimica • Desorbimento (MALDI, elettrospray) • Fotoionizzazione

6. Sorgenti ioniche Stato del campione Sorgente Liquido Elettrospray – nanospray APCI (atmospheric pressure chemical ionization) APPI (atmospheric pressure photoionization) LC: flussi ~ 0.1 – 1 cm3 min-1. Se l’eluente è acqua, 0.1 cm3 min-1 = 5.6 mmol min-1 = 135 cm3 min-1 (c.n.) Nano-HPLC: flussi ~ 10-4 cm3 min-1 0.1 cm3 min (c.n.)

7. Sistemi di introduzione del campione Introduzione di campioni solidi o liquidi • Sistemi a carica (off line) • Il campione viene volatilizzato termicamente ed inviato nella zona di ionizzazione. • Sistemi a sonda • Per solidi, liquidi non volatili e per campioni in piccole quantità • Sistemi per iniezione diretta (o per FIA) • Per inviare campioni liquidi ad interfacce a flusso (es. elettrospray) • Sistemi separativi in fase liquida (LC, CE, FFF) • Interfaccia online con interfacce a flusso

8. Sorgenti ioniche a desorbimento • Elettrospray – nanospray • Bombardamento con atomi veloci (FAB) • Desorbimento/ionizzazione per impatto ionico • Desorbimento-ionizzazione laser assistiti da matrice (MALDI)

9. Meccanismo fisico dell’elettrospray L’applicazione di un potenziale elettrico ad alto voltaggio ad una goccia di liquido ne provoca la frammentazione in goccioline fini. La causa e’ la repulsione elettrostatica tra le cariche che si generano nella goccia.

10. Sistema di nebulizzazione elettrospray Cono di Taylor Punta dell’ago

11. Sistema di desolvatazione per elettrospray Gocce di circa 1 µm Gas didesolvatazione Gas ditrasporto Liquido ditrasporto Campione Cono di Taylor Capillare riscaldato - + 2-6 kV

12. Meccanismo di deplezione degli ioni Calore o gas secco Soluzione del campione Spettrometro di massa 4000 V Pressione atmosferica Il calore e/o il gas secco causano la riduzione delle dimensioni delle gocce Vapori del solvente Livelli successivi di vuoto(2 torr – 0.1 torr – 0.01 torr) Esplosione Coulombiana Limite di Rayleigh: Limite di dimensioni della al quale si prevede la frammentazione della goccia. q2 = 8π2ε0γd3 q = carica totale della goccia ε0 = permittività elettrica del mezzo γ = tensione superficiale della goccia d = diametro della goccia

13. Ionizzazione elettrospray • Processo di “evaporazione degli ioni” • Nebulizzazione del campione (Cono di Taylor) • Evaporazione del solvente (desolvatazione) • Deplezione degli ioni(esplosione coulombiana) • Modelli di deplezione:desorbimento o evaporazione del solvente

14. Nanospray con geometria “a Z” Accoppiamento nanoHPLC-MS

15. L’elettrospray genera spettri multicarica m/z La carica degli ioni è dovuta agli ioni metallici (es Na+) o ai protoni associati alla molecola. Gli addotti carichi sono quindi della forma: (M + H)+, (M + 2H)2+, …, (M + nH)n+

16. Calcolo della massa da uno spettro multicarica Siano A1 e A2 i valori di m/z per due picchi dello spettro multicarica. Se supponiamo che gli addotti siano formati da H+ (Mr = 1,0079) si ha: Se z1 = z2 + 1(picchi consecutivi) Risolvendo il sistema si ha:

17. Ionizzazione chimica a pressione atmosferica (APCI) LC-APCI/MS

18. Ionizzazione chimica a pressione atmosferica • Sorgente ionica analoga alla CI, in cui la ionizzazione avviene per reazioni ione-molecola a pressione atmosferica • Gli ioni primari vengono generati a pressione atmosferica mediante scariche a corona nel solvente nebulizzato o mediante emissione β-. • Si applica a molecole ioniche o polari, di massa molare fino a circa 1500. • Può funzionare sia in modalità positiva che negativa genera prevalentemente ioni monocarica.

19. ESI vs APCI - Sensibilità Sensibilità relativa Flusso (µL/min) La ESI è sensibile alla concentrazione dell’analita, la APCI alla sua quantità. Per questo la ESI si presta ad essere accoppiata alla micro e nano HPLC.

20. Sorgente ionica a fotoionizzazione

21. Sorgente ionica a fotoionizzazione • Sorgente ionica a pressione atmosferica (APPI) di recente introduzione • Una lampada UV a Kr emette fotoni di energia ~ 10 eV. • L’energia dei fotoni è tale da ionizzare selettivamente un’ampia classe di molecole organiche, senza ionizzare il solvente. • È adatta a molecole piccole e poco polari, che sono difficilmente ionizzabili con altri metodi. • È una sorgente estremamente soft, e rappresenta un’alternativa alla APCI e alla ESI per la ionizzazione a pressione atmosferica.

22. Applicabilità delle sorgenti a pressione atmosferica

23. Sorgenti ioniche a desorbimento Desorbimento/ionizzazione laser assistiti da matrice (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization, MALDI) • L’analita viene codepositato su un bersaglio con una matrice, scelta per favorire la vaporizzazione dell’analita. • Caratteristiche della matrice: • Elevata assorbività alla lunghezza d’onda del laser. • Massa molare abbastanza bassa da sublimare facilmente. • Bassa reattività chimica. • Stabilità al vuoto. • Le matrici più utilizzate sono acidi aromatici

24. Matrici per ionizzazione MALDI Acido α-ciano-4-idrossicinnamico

25. Portacampione per MALDI

26. Il processo MALDI Il bersaglio viene colpito da un impulso laser che viene assorbito dalla matrice e provoca la formazione di un plasma contenente gli atomi dell’analita ed atomi e ioni della matrice.

27. Preparazione del campione per MALDI Il metodo più comune per la preparazione di un campione per MALDI è la dried-droplet. Una certa quantità di soluzione satura della matrice (5-10 µL) viene miscelata ad un volume minore di campione (1-2 µL) Una goccia (0.5 – 2 µL) della miscela ottenuta si deposita sulla piastrina portacampione del MALDI e si fa asciugare a T ambiente, in modo che cristallizzi completamente prima di essere introdotta nello spettrometro di massa.

28. Sorgenti laser per MALDI • Laser a N2 (337 nm), Nd-YAG (266 e 355 nm) o IR (Er-YAG, 2.94 µm). • Energia del laser: 106 – 1010 W cm-2 • Diametro dello spot laser: < 1 µm • Durata dell’impulso: ~10 - 100 ns • Misure ottenute sulla media di 50 – 100 colpi.

29. Il processo MALDI • La ionizzazione avviene per trasferimento di carica dagli ioni della matrice alle molecole del solvente, secondo un processo non del tutto noto che porta alla prevalente formazione di ioni monocarica non frammentati. • L’eventuale frammentazione può avvenire secondo tre meccanismi: • frammentazione immediata: avviene durante il processo di desorbimento/ionizzazione • frammentazione veloce: avviene dopo la ionizzazione ma prima dell’accelerazione degli ioni verso l’analizzatore di massa • frammentazione per decadimento port-sorgente (PSD): avviene dopo l’accelerazione degli ioni (ad esempio nel tubo di volo). In questo caso i frammenti non possono essere risolti dallo ione molecolare.

30. MALDI-TOF MS Range di massa fino a 106 Analizzatore a tempo di volo.

31. Lo spettro di massa Intensità relativa m/z Spettro di massa di ioni monocarica (MALDI/TOFMS) Spettro di massa del batterio intero Escherichia coli

32. MALDI: vantaggi e limitazioni • Poco sensibile alle contaminazioni (sali, tamponi, detergenti ecc.) Solitamente non richiede complessi passaggi di purificazione del campione. • Può analizzare velocemente miscele complesse di analiti (lo spettro è facile da interpretare) • Non è una sorgente a flusso • La ionizzazione è un processo competitivo, per cui la simultanea presenza di più analiti può dare luogo ad interferenze. • L’analisi quantitativa è limitata dalla ridotta omogeneità del campione.

33. Schema di uno spettrometro di massa Computer Segnale Sistema di introduzione Sorgente di ioni Analizzatore di massa Rivelatore Campione (gassoso) Ioni Ioni 10-5-10-8 torr Campione Sistema di vuoto

34. Analizzatore di massa • Fa sì che al rivelatore arrivino ioni in un ristretto intervallo di massa. • Determina in gran parte il potere risolvente dello spettrometro di massa. • Deve garantire una buona trasmissione e focalizzazione degli ioni.

35. Risoluzione La capacità di uno spettrometro di massa di differenziare le masse è generalmente espressa dalla risoluzione R definita come: R = m/Δm dove Δm è la differenza di massa tra due picchi adiacenti risolti e m è la massa nominale del primo picco (o la media delle masse dei due picchi). Due picchi sono considerati separati se l’altezza della valle tra di essi è inferiore ad una certa percentuale della loro altezza (di solito il 10%). Uno spettrometro con una risoluzione di 4 000 risolverà due picchi con valori di m/z 400,0 e 400,1 (o di 40,00 e 40,01). Gli spettrometri commerciali hanno R che variano circa tra 500 e 500 000.

36. Risoluzione Picchi risolti al 10% della valle Intensità Picchi risolti al 80% della valle Definizione alternativa La risoluzione di un picco isolato si può anche definire come larghezza δm del picco al x% dell’altezza. Spesso si prende x = 50%, e δm è la larghezza a metà altezza.

37. Classi di analizzatori di massa • A settore magnetico • A doppia focalizzazione • A quadrupolo lineare (Q) • Trappola ionica a quadrupolo (QIT) • A tempo di volo (TOF) • A risonanza ciclotronica e trasformata di Fourier (FT-ICR)

38. Analizzatore di massa a quadrupolo Potenziale nel quadrupolo

39. Quadrupolo ideale ad elettrodi iperbolici

40. Campo “a sella” del quadrupolo Al centro del quadrupolo lo ione si trova in un potenziale elettrico a sella, che ruota alla frequenza del campo a RF. L’energia dello ione viene continuamente convertita da cinetica a potenziale e viceversa. Lo ione assume quindi un moto oscillatorio attorno alla posizione di equilibrio (sull’asse del quadrupolo), con una frequenza ed un ampiezza di oscillazione che dipendono dalla frequenza e ampiezza del campo, dalla massa e dalla carica dello ione.

41. Traiettorie dello ione piano xz piano yz piano xz Traiettoria instabile lungo x, stabile lungo y piano yz Traiettoria stabile sia lungo x che lungo y

42. Equazioni del moto dello ione Seconda legge di Newton Introducendo l’espressione del campo Φ

43. Equazione di Mathieu Dalle equazioni del moto mediante un cambio di variabili (t, U, V)  (ξ, a, q) si ha:

44. Diagramma di stabilità del quadrupolo stabile lungo x stabile lungo y Aree di stabilità per uno ione lungo gli assi x e y. A-D: aree di stabilità sul piano x-y. In MS si sfrutta normalmente la zona A. La zona ombreggiata si riferisce a potenziale U positivo.

45. Filtro di massa a quadrupolo a (funzione del potenziale a DC, U) linea di scansione di massa q (funzione dell’ampiezza del potenziale a RF, V) La linea di scansione di massa è il luogo geometrico dei punti (a, q) per gli ioni a U, V, ω e r0fissati. Siccome a/q non dipende da m/z, tutti i punti stanno su una retta di pendenza 2U/V.

46. Scansione di m/z in un quadrupolo linea di scansione di massa Variando U e V, senza variare il rapporto U/V, si realizza la scansione di massa.

47. Analizzatore di massa a quadrupolo • Massimo valore m/z ~ 4 000 • Risoluzione ~ 3 000 • I quadrupoli sono strumenti a bassa risoluzione • Si lavora normalmente alla risoluzione di una unità di massa. • Leggero, di dimensioni contenute • Facile da accoppiare alla cromatografia • Efficiente trasmissione degli ioni • Necessaria una elevata precisione nell’allineamento delle barre degli elettrodi

48. Classi di analizzatori di massa • A settore magnetico • A doppia focalizzazione • A quadrupolo lineare (Q) • Trappola ionica a quadrupolo (QIT) • A tempo di volo (TOF) • A risonanza ciclotronica e trasformata di Fourier (FT-ICR)

49. Trappola ionica a quadrupolo Filamento Elettrodo acalotta (end-cap) Elettrodoad anello Rivelatore Generatoresupplementaredi RF Generatore di RF Processoredi scansione

50. Trappola ionica a quadrupolo