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Extração e purificação dos antígenos imunodominantes de Corynebacterium pseudotuberculosis

Extração e purificação dos antígenos imunodominantes de Corynebacterium pseudotuberculosis. Revisão bibliográfica Os antígenos Extração Purificação Material e método Extração Purificação. Representação esquemática da localização das frações antigênicas de C. pseudotuberculosis. Ag.

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Extração e purificação dos antígenos imunodominantes de Corynebacterium pseudotuberculosis

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Presentation Transcript

  1. Extração e purificação dos antígenos imunodominantes de Corynebacterium pseudotuberculosis • Revisão bibliográfica • Os antígenos • Extração • Purificação • Material e método • Extração • Purificação

  2. Representação esquemática da localização das frações antigênicas de C. pseudotuberculosis Ag. Extra celulares Ag. de parede / membrana Peptidoglicano Ácidos teicóicos Ag. Intra celulares? Membrana Parede Camada lipídica Ag. fracamente ligados à parede

  3. As frações antigénicas de Corynebacterium pseudotuberculosis Antígenos extracelulares Antígenos fracamente ligados à parede Antígenos celulares (parede/membrana, intracelulares)

  4. Extração dos antígenos de C. pseudotuberculosis

  5. Purificação dos antígenos de C. pseudotuberculosis

  6. S-Layer (1)

  7. Extracelulares (4)

  8. Celulares (3)

  9. Obtenção de soro para imunodifusão e Cromatografia de imunoafinidade (E. Harlow and D. Lane, 1988, Weare et al, 1982) Imunodifusão Frações antigénicas extraídas (4) C. Imunoafinidade Reversa Frações obtidas a partir de PAGE NÃO DESNATURANTE • Esquema de vacinação: (3 coelhos por extrato) • Injeção inicial SC: 0,5 mg de proteína com adjuvante de Freund completo, • Boosts a cada 30 dias, 0,25 mg, SC (Freund incompleto) ou IV (Ag sem adjuvante) • Sangria 15 dias após cada boost. • Preparação do soro: • Aquecimento 56ºC, 30 min. • Precipitação com (NH4)2SO4 ou Cromatografia Exclusão • Resuspensão em NaHCO3(CIAR) • Desalinização (Diálise ou Sephadex G-25) (ID)

  10. Celulares (3) Extracelulares (4) PAGE não desnaturante Bandas contaminantes Gel de Sepharose 6MB ativado com Brometo de cyanógeno + Sóro anti “Contaminantes” Cromatografia de Imunoafinidade Reversa

  11. Controle de qualidade Extração por detergentes/Sonicado Outros Extratos E. Intracelulares (2) Lowry PAGE / Imunoblot E. S-Layer (1) E. Celulares (3) E. Extracelulares (4) EXTRAÇÃO Soro ID (4) Extratos 3 e 4 Extratos 1 e 2 • Lowry • Soro ID • PAGE / Imunoblot C. I. A. R. C. Exclusão C. Exclusão PURIFICAÇÃO

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