Filoviridae και ο ιός ΕΒΟ LA

1. Filoviridae και ο ιός ΕΒΟLA Παρουσίαση στα Ειδικά Θέματα Κυτταρικής Βιολογίας Διδάσκουσα: Ι.Παπασίδερη Κυριλής φώτης Α.Μ. 220065

2. Επισκόπηση του σεμιναρίου • Δομή του Ιού • Γονιδίωμα του Ιού • Κύκλος αντιγραφής του • Πρωτεΐνες που συμμετέχουν σε αυτήν • Οικολογία • Παθογένεση

3. Ηλεκτρονική μικροσκοπία του Μarburg

4. Φωτογραφίες Δομής του Ebola από ηλεκτρονική μικροσκοπία

5. ΜΕΡΟΣ Β: ΓΟΝΙΔΙΩΜΑ ΤΟΥ ΕBOLA

6. Σχεδιάγραμμα του ιού. Παρατηρούμε τις περιοχές των γονιδίων του, το σχήμα και τα ετεροδιμερή των γλυκοπρωτεΐνών του.

7. Γονιδίωμα του ΕΒΟ-Ζ. Διακρίνουμε το μέγεθός του, τις περιοχές που εντοπίζονται τα γονίδιά του(πράσινο χρώμα), και τις κόκκινες περιοχές, που είναι διαγονιδιακές.

8. Το γονιδίωμά του, λοιπόν... • Αποτελείται από (-)ssRNA • Περιέχει 7 πρωτεΐνες • Και παρουσιάζεται επικάλυψη γονιδίων, γνωστό ως gene overlapping.

9. Το γονίδιο 4 μεταγράφεται από δύο ανοιχτές περιοχές. Πρώτα παράγεται μία μικρή γλυκοπρωτεΐνη, sGP, και μετά με RNA editing και μεταγραφικό frameshifting εκφράζεται η τελική GP.

10. Οι πρωτεΐνες του Ιού. • GP(αποτελείται από τα GP1 και 2): ΔΙΑΜΕΜΒΡΑΝΙΚΗ ΓΛΥΚΟΠΡΩΤΕΪΝΗ • ΝΡ: ΝΟΥΚΛΕΟΚΑΨΙΔΙΚΗ ΠΡΩΤΕΪΝΗ, ΑΠΑΡΑΙΤΗΤΗ ΓΙΑ ΤΗΝ ΣΥΝΑΡΜΟΛΟΓΗΣΗ ΤΟΥ ΦΑΚΕΛΟΥ. • VP24: άγνωστης λειτουργίας • VP30: φέρει την παραγωγή IFN • VP35: anti-terminator της μεταγραφής • VP40: απαραίτητη για την δόμηση του καψιδίου και την ωρίμανση του ιού • ΙΙΚΗ ΠΟΛΥΜΕΡΑΣΗ λ.

11. Sequensing της GP2 πρωτεΐνης

12. 1. Είσοδος στο ξενιστικό κύτταρο. • Έρχεται σε επαφή με τα υγρά του σώματος και εισάγεται στα κύτταρα μέσω βλέννας ή κατ’ευθείαν στο αίμα.

13. 2. Προσρόφηση. • Η γλυκοπρωτεΐνη GP1 δένει με έναν κυτταρικό υποδοχέα. Τεράστια συνεισφορά της GP2. • Μεσολαβούν πολλοί κυτταρικοί συμπαράγοντες, όπως ο fotolate υποδοχέας α. • Οι πρωταρχικοί στόχοι του EBOLA είναι -Μονοπυρηνικά φαγοκύτταρα -Monocytes

14. ΜΕΡΟΣ Γ: ΟΙ ΠΡΩΤΕΪΝΕΣ ΤΟΥ EBOLA ΜΕΜΒΡΑΝΗ ΚΥΤΤΑΡΟΥ ΠΡΩΤΕΙΝΗ GP ΙΙΚΗ ΜΕΜΒΡΑΝΗ

15. 3. Ενδοκύττωση. • Το PH του κυττάρου γίνεται πιο όξινο κατά την ενδοκύττωσή του. • Η GP2p, λειτουργεί ως συμπαράγοντας στη συγχώνευση της μεμβράνης του με του κυττάρου. • Συμμετέχει πληθώρα πρωτεϊνών του κυττάρου, που ακόμη δεν έχει διασαφηνιστεί ποιες είναι • Απελευθέρωση του γονιδιώματος του ιού στο κύτταρο.

16. 4α. Σύνθεση πρωτεϊνών λ, VP35, VP40 • Απαιτεί την παρουσία της ιικής πολυμεράσης λ. • Η VP30 πρωτεΐνη, επιτρέπει Downstream μεταγραφή των γονιδίων, από το πρώτο γονίδιο. • Η VP35 πρωτεΐνη δρα αναχαιτίζοντας την κυτταρική άμυνα.

17. 4β. Σύνθεση των GP πρωτεϊνών • Είναι πολύπλοκη μετα-μεταγραφική διεργασία • Γίνεται γλυκοζυλίωση των πρωτεϊνών • Πρωτεολυτικό μάτισμα από πρωτεάσες • Ακετυλίωση

18. Οι γλυκοπρωτεΐνες του Ebola • Οι GP1 και GP2 πρωτεΐνες συμμετέχουν στην αναδόμηση και αυτόματη συναρμολόγηση του καψιδίου, καθώς και στην είσοδο του ιού στο κύτταρο. • sGP, μοναδική, διαλυτή πρωτεΐνη αγνώστου λειτουργίας

19. Βιοσύνθεση των γλυκοπρωτεϊνών

20. Οπότε, το πλήρες ιόσωμα περιλαμβάνει: • ssRNA,NP,VP30, VP35, VP24, λ Τελικά, κατά την απελευθέρωση καταστρέφεται το κύτταρο ξενιστής, δίνοντας περίπου 30-300 νέους ιούς, οι οποίοι θα προσβάλλουν τα γειτονικά κύτταρα. Έχει παρατηρηθεί(εργαστηριακά) το φαινόμενο της Lysis from without.

21. ΜΕΡΟΣ Ε: Αλληλεπιδράσεις με το ανοσοποιητικό σύστημα • Στοχεύει κύτταρά του, τα οποία μεταφέρουν τα νέα ιοσώματα σε όλους τους ιστούς. • Υπάρχει πρώιμη μόλυνση και των δενδριτικών κυττάρων, οπότε αργοπορεί συγκεκριμένη ανοσοποιητική δράση (ανοσοαπάντηση)

22. Αλληλεπιδράσεις με το ανοσοποιητικό σύστημα • Μόλυνση και καταστροφή των μακροφάγων και των ουδετερόφιλων • Δεν υφίσταται καμμία ανοσολογική απάντηση, αφού οι πρωτεΐνες του ιού (η VP35) καταστέλλουν τα IFN γονίδια

23. Παθογένεση • Οι γλυκοπρωτεΐνες του είναι υπεύθυνες για τη παθογένεση • Στοιχεία αποδυκνείουν πως τα συμπώματα, αν όχι όλα, τα περισσότερα, δεν είναι προκαλούμενα απ’ευθείας από τον ιό, αλλά η παθολογία του είναι απόρροια μια σειράς αποκρίσεων.

24. Παθογένεση • Ολική ανοσοαπόκριση • Ενεργοποίηση των μακροφάγων και των μονοκυττάρων • Απελευθέρωση προλοιμωξιακών σημάτων • Κυτοκινίνες, TNF, IFN. • Συντριβή των ενδοθηλιακών εμποδίων • Το αίμα εισέρχεται σε όλους τους ιστούς, πέφτει η πίεση σοκ.

25. Αιμορραγικός πυρετός Ebola Ύστερα: εξανθήματα, κόκκινα μάτια, εσωτερική και εξωτερική αιμμοραγία Θάνατος σε τεράστια ποσοστά: 58-94% των περιπτώσεων • 2-21 ημέρες επώασης • Συμπτώματα ίωσης

26. Biological Level 4

27. ΟΙΚΟΛΟΓΙΑ ΤΟΥ EBOLA • O φυσικός του ξενιστής είναι άγνωστος. • Έχουν υποστηριχτεί οι πίθηκοι, κατώτερα ζώα, ακόμη και φυτά • Ο Ebola δενείναι αερομεταφερόμενος ιός

28. Δεν γνωρίζουμε... • Γιατί κάποιοι έχουν επιζήσει; • Υπάρχει μεγαλύτερη ανοσοαπόκριση σε κείνουν που επιζούν. Αλλά σε κάποιους υπήρξε μικρότερη. • Ο ιός μπορεί να μείνει μέχρι τρεις μήνες στα κύτταρα του ξενιστή

29. Αντιμετώπιση Δεν υπάρχει αποτελεσματική θεραπεία για τον ιό. Πλασμιδιακή μεταγωγή, Θεραπεία με υποκατάστατα του ιού. Με μεταγγίσεις αίματος, στεροειδή.

30. Ebola σαν βιολογικό όπλο • Η Ρωσία μέχρι το 1992 παρήγαγε και είχε τεράστιες ποσότητες του ιού στα εργαστήρια και διεξήγαγε πειράματα γενετικής σε αυτόν, ώστε να υφίσταται ποικιλότροπες μεταλλαγές • Ο Ιάπωνας τρομοκράτης Aum Shinrikyoαποκαλύφθηκε πως προσπάθησε να εμπορευτεί την αγορά του ιού.

31. Για να κλείσουμε... • Γίνεται τεράστια έρευνα στους Filoviridae, και αυτό γιατί είναι οι πιο θανατηφόροι ιοί και δεν αντιμετωπίζονται. • Έχουν μικρό γονιδίωμα, και 7 πρωτεΐνες. • Μπορεί να επιτευχθεί καλλιέργειά τους για μελέτη τους • Ο κύκλος αντιγραφής του είναι ταχύς, αποδοτικός και παρόμοιος με των Rabdoviridae

32. Filoviridae και ο ιός ΕΒΟLA Παρουσίαση στα Ειδικά Θέματα Κυτταρικής Βιολογίας Διδάσκουσα: Ι.Παπασίδερη Κοκκαλιάρης Κ. Α.Μ. 220053

33. Η ΑΝΤΙΓΡΑΦΗ ΤΩΝ ΙΩΝ MARBURG & EBOLA ΣΕ ΑΝΘΡΩΠΙΝΑ ΕΝΔΟΘΗΛΙΑΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ • Οι ιοί Marburg και Ebola, μέλη της οικογένειας των Filoviridae, προκαλούν αιμορραγικές ασθένειες στους ανθρώπους και γενικά στα πρωτεύοντα • Η ασθένεια μπορεί να χαρακτηριστεί ως μία παντροπική ασθένεια που συνήθως έχει ως συμπτώματα ένα βίαιο σοκ συνοδευόμενο από αιμορραγία, που φτάνει στις περισσότερες περιπτώσεις έως και τον θάνατο • Ο MBG, που συνιστά και τον πρωτότυπο φιλοϊό, απομονώθηκε το 1967 μετά από τις εξάρσεις αιμορραγικών πυρετών σε ανθρώπους στην Γερμανία και τη Γιουγκοσλαβία • Μελέτες που έγιναν στο παρελθόν πρότειναν μία μη ειδική καταστροφή του ενδοθηλίου σαν τον επικρατέστερο μηχανισμό

34. Ενδοθηλιακά κύτταρα σχηματίζουν την εσωτερική επιφάνεια των αγγείων και διαδραματίζουν έναν ρόλο κλειδί στην διατήρηση της πίεσης και της ομοιόστασης • Αυτά τα κύτταρα σχηματίζουν ένα επιλεκτικό εμπόδιο που ουσιαστικά αποτελεί ένα μέσο ελέγχου της ανταλλαγής μικρών διαλυτών ουσιών και μακρομοριακών μη διαλυτών ουσιών μεταξύ του αίματος και στο μεσοκυττάριο υγρό των ιστών • Η αντιγραφή του ιού που προκαλεί την καταστροφή του ενδοθηλίου είναι ένας μηχανισμός που πιθανά ευθύνεται για τον αιμορραγικό πυρετό και το σύνδρομο σοκ που τυπικά ακολουθούν την μόλυνση από τον ιό Marburg • Να διευκρινιστεί ότι η οικογένεια των Filoviridae περιλαμβάνει τον ιό Marburg (MBG), τους δύο συγγενικούς ιού Ebola (EBO) και τον ιό Reston (RES), που πρόσφατα απομονώθηκε

35. Οι ιστολογικές και παθοφυσιολογικές παράμετροι που είναι σήμερα γνωστές για την ασθένεια που καλείται αιμορραγικός πυρετός και προκαλείται από τους εν λόγω ιούς, δεν είναι επαρκείς ώστε να εξαχθούν συμπεράσματα για τα προκαλούμενα συμπτώματα • Η μόλυνση από φιλοϊούς έχει συγκεκριμένα παθολογικά χαρακτηριστικά, που είναι κοινά στα μέλη των τριών οικογενειών, και συνοδεύονται από αιμορραγικούς πυρετούς διαφορετικών τύπων • Κάποιοι από τους τύπους αιμορραγικών πυρετών που έχουν χαρακτηριστεί σχετικά πρόσφατα είναι ο “πυρετός της Λάσα”, ο αιμορραγικός πυρετός που συνοδεύεται από κάποιο σύνδρομο νεφρικής ανεπάρκειας, και ο αιμορραγικός πυρετός Dungue • Πρέπει να τονιστεί ότι οι φιλοϊοι εμφανίζουν τα υψηλότερα ποσοστά θνησιμότητας που ξεκινούν από 35% και φτάνουν έως και 90% για τον ιό Ebola τύπου Ζαΐρ, και τις πιο σοβαρές εμφανίσεις αιμορραγικών πυρετών

36. Η λύση των ενδοθηλιακών κυττάρων παρατηρείται κατά την εξέλιξη του συνδρόμου σοκ που εντοπίζεται στον πνεύμονα και συχνά σχετίζεται με φαινόμενα θρομβώσεων στοευρύτερο διαγγειακό σύστημα • Έχει γίνει η υπόθεση ότι αυτό προκαλείται από την καταστροφή των ενδοθηλιακών κυττάρων, που προκαλείται ως απάντηση στην μόλυνση από τον ιό • Για να οριστεί το αν η δυσλειτουργία και η επακόλουθη καταστροφή των ενδοθηλιακών κυττάρων μπορεί να προκληθεί από την μόλυνση από φιλοϊό, έγινε εξέταση της ανοσολογικής απάντησης στον ιό Marburg σε καλλιέργειες ανθρώπινων ενδοθηλιακών κυττάρων ομφάλιου λώρου (HUVEC) καθώς και σε οργανική καλλιέργεια ανθρώπινων αγγείων από ομφάλιο λώρο • Τα δεδομένα έδειξαν ότι ο ιός Marburg εντοπίσθηκε και στα δύο συστήματα και προτάθηκε ότι η καταστροφή που παρατηρείται στα ενδοθηλιακά κύτταρα κατόπιν μόλυνσης από τον ιό οφείλεται στον πολλαπλασιασμό του ιού

38. Για να αποδειχτεί ότι τα ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα του ομφάλιου λώρου (HUVEC) που προσβάλλονται από τον ιό Marburg (MBG) είναι μολυσματικά, εκτελέσθηκε η μέθοδος plaque assaysσε Ε6 κύτταρα από καλλιέργειες μολυσμένων ενδοθηλιακών κυττάρων, τα οποία συλλέχθηκαν 8 έως 144 ώρες μετά την μόλυνση. • Για λόγους σύγκρισης, παράλληλα έγινε προσπάθεια να διευκρινιστεί η καθορισμένη κυτταρική πορεία που ακολουθείται κατά την ανάπτυξη-πολλαπλασιασμό του ιού εντός του κυττάρου καθώς και δευτερευόντως την πορεία μετα-μόλυνσης άλλων γειτονικών ή μη κυττάρων • Η μορφολογία των HUVEC και των Ε6 τα οποία είναι μολυσμένα με τον ιό Marburg και στα οποία ο ιός αρχίζει να πολλαπλασιάζεται, δεν εμφανίζουν σημαντικές διαφορές. • Τα αποτελέσματα αυτά αποδεικνύουν ότι τα ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα είναι δεκτικά (αποτελούν στόχο) του ιού Marburg

43. Είναι γενικά αποδεκτό ότι η εξέλιξη του συνδρόμου σοκ βρίσκεται σε άμεσο συσχετισμό με την απώλεια της ακεραιότητας του ενδοθηλιακού ιστού, που οφείλεται κυρίως στον αυξανόμενο ρυθμό εισόδου των ιοσωμάτων στα κύτταρα του ενδοθηλίου • Στην ασθένεια Marburg αυτό μπορεί να οφείλεται σε ορισμένους μηχανισμούς α.) λύση των ενδοθηλιακών κυττάρων οφειλόμενη στην αντιγραφή του ιού, β.) μαζική απελευθέρωση των ανοσολογικών παραγόντων από μη ειδική (φαγοκύτωση) και ειδική (αντιγραφή ιού) ενεργοποίηση των ανοσολογικών κυττάρωνκαι γ.) οξειδωτικός τραυματισμός ή μη ειδική ανοσολογική απάντηση όπως αναφέρθηκε προηγουμένως • Σχετικά νωρίς μετά την μόλυνση παρατηρούνται τεράστιες περιοχές στις οποίες εντοπίζονται κυτταρικές καταστροφές, οι οποίες ακολουθούνται από μία γενικευμένη καταστροφή των ενδοθηλιακών κυττάρων κατά την εξέλιξη της μόλυνσης • Ο αναπτυσσόμενος ιός είναι άκρως μολυσματικός και τα ιϊκά κομμάτια που εντοπίζονται στα μολυσμένα ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα είναι πανομοιότυπα με αυτά των Ε6 κυττάρων • Η καταστροφή των ενδοθηλιακών κυττάρων που παρατηρείται στα μετέπειτα στάδια της μόλυνσης κρίνεται πλέον επαρκής για να ξεκινήσει η αγγειακή πήξη και να παρουσιαστούν συμπτώματα θρόμβωσης (DIC) σε συνδυασμό με την κατανάλωση των πηκτικών παραγόντων όπως αρχικά συζητήθηκε για την μέθοδο μόλυνσης των φιλοϊών

44. Η ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΜΙΑΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΑΝΟΣΟΦΘΟΡΙΣΜΟΥ ΓΙΑ ΤΗΝ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΩΝ ΓΙΑ ΤΟΝ ΙΟ EBOLA, ΤΥΠΟΣ RESTON, ΜΕ ΤΗΝ ΧΡΗΣΗ ΜΙΑΣ ΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΕΝΗΣ ΝΟΥΚΛΕΟΠΡΩΤΕΪΝΗΣ- ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΣΕ ΚΥΤΤΑΡΑ HeLa • Αναπτύχθηκε μία έμμεση μέθοδος-ανάλυση του ανοσοφθορισμού (IFA) με σκοπό την ανίχνευση αντισωμάτων για τον ιό Ebola, τύπος Reston (EBO-R), χρησιμοποιώντας τις κυτταρικές σειρές HeLa όπου παρατηρείται και η έκφραση των EBO-R νουκλεοπρωτεϊνών (ΝΡ) • Η εν λόγω μέθοδος εμφανίζει αυξημένη ειδικότητα για την ανίχνευση των EBO-R IgG αντισωμάτων και στα υπεράνοσα κουνέλια και στους πιθήκους που συνελλέχθησαν κατά την διάρκεια ενός ξεσπάσματος του EBO-R στις Φιλιππίνες το 1996

45. Αξιοσημείωτο είναι το γεγονός ότι η χρησιμοποιούμενη μέθοδος IFA παρουσιάζει και αυξημένη ευαισθησία για τα μελετούμενα αντισώματα για τον EBO-R σε σχέση με την IFA που μελετά την έκφραση στην κυτταρική σειρά HeLa των αντίστοιχων νουκλεοπρωτεϊνών του Ebola, τύπος Ζαΐρ • Τα αποτελέσματα της παρούσας εργασίας υποδεικνύουν ότι αυτή η νέα ανοσοφθοριστική μέθοδος-ανάλυση θα αποτελέσει ένα πολύ χρήσιμο εργαλείο για επιδημιολογικές μελέτες όσον αφορά τον ιό Ebola και την μολυσματική δράση του πρωτίστως σε πιθήκους • Φυσικά, αναμένεται αν όχι η άμεση επέκταση των αποτελεσμάτων στους ανθρώπους, τουλάχιστον η πραγματοποίηση των βασικών βημάτων για την ανάπτυξη μίας μεθόδου με αντίστοιχη ευαισθησία και ειδικότητα κατάλληλη για τους ανθρώπους • Χρησιμοποιήθηκαν 16 συγγενείς πίθηκοι που εξήχθησαν από αντίστοιχη αναπαραγωγική μονάδα (μονάδα Α) στις Φιλιππίνες και που είχαν αντιμετωπίσει το επιδημιολογικό ξέσπασμα του 1996. • Επίσης μελετήθηκαν 96 πίθηκοι από τους οποίους απομονώθηκε δείγμα ορού και που προέρχονταν από άλλη μονάδα αναπαραγωγής (μονάδα Β) των Φιλιππινών όπου δεν είχε αναφερθεί κανένα ξέσπασμα του ιού Ebola.

47. Αυτή η IFA παρουσιάζει έναν αυξημένο αριθμό πλεονεκτημάτων σε σύγκριση με την IFA που χρησιμοποιεί μολυσμένα από τον ιό κύτταρα, επειδή αυτές οι κυτταρικές σειρές μπορούν να προετοιμαστούν και ακολούθως να χρησιμοποιηθούν με απόλυτη ασφάλεια σε εργαστήρια χωρίς εφαρμογή εξειδικευμένων συνθηκών ασφαλείας (biosafety level 4 facilities) που σε άλλες περιπτώσεις κρίνονται κάτι παραπάνω από απαραίτητες

48. Kastritis PL, Kokkaliaris DK, Kirilis LF Filoviridae και ο ιός ΕΒΟLA Παρουσίαση στα Ειδικά Θέματα Κυτταρικής Βιολογίας Διδάσκουσα:Ι.Παπασίδερη Παναγιώτης Καστρίτης Α.Μ. 220050

49. Kastritis PL, Kokkaliaris DK, Kirilis LF Ηλεκτρονική Μικροσκοπία Χ 90.000 Είναι πλειομορφικοί Νηματώδεις Ραβδοειδείς Διάμετρος: 80nm Mήκος: 130-140000nm Έχουν περίβλημα Αποσπασμένο διαγνωστικό δείγμα από την πρώτη μετάβαση κυττάρων Vero, που παρουσιάζει την επιμηκυμένη μορφή μορίων

50. Kastritis PL, Kokkaliaris DK, Kirilis LF Διαμορφώσεις windings της εσωτερικής δομής Χ 39.000 Χ 28.000. Χ 66.000.