İMMUNOLOJİK TANI YÖNTEMLERİ

1. İMMUNOLOJİK TANI YÖNTEMLERİ Prof. Dr. Bekir KOCAZEYBEK

2. I- GENEL BAKIŞ; • KLİNİK İMMUNOLOJİDE HASTALIĞIN TANISI İÇİN • Çok iyi bir ÖYKÜ alınması • FİZİKİ İNCELEME yapılması • Uygun TANI TESTİNİN yapılması ZORUNLUDUR

3. a)ÖYKÜ: KLİNİK İMMUNOLOJİ UZMANINA BAŞVURU NEDENLERİ(sıklık sırasıyla); • ENFEKSİYONLAR (en sık) Yineleyen enfeksiyon  Çocuklarda bulaşıcı ÜSYE çok sıktır  Bu çocuklarda sekonder olarak ♣ Otit, sinüzit, bronşit gelişebilir  Bu hastalıklar diğer çocuklara görülmesine göre daha sıksa ♣Antibiyotik almayı gerektiriyorsa Ig G alt sınıf yetersizliği vardır  Deri ve ÜSYE’nin; ♣6-12 aydan sonra başlaması ♣Sık ve birincil olması Ig yetersizliğini gösterir

4. Çok ağır enfeksiyonlar  Ağır viral enfeksiyonlar T hücre yetersizliği  Ağırbakteri enfeksiyonlar B hücre yetersizliğini gösterir Fırsatçı mikroorganizmalarla enfeksiyon  Hastane enfeksiyon etkenleri  KİT’ de CMVenfeksiyonu Doğal ve özgül immunitede ♣Özellikle T hücre bozukluğu

5. Kendine özgü mikroorganizmlarla enfeksiyon  Aspleniklerde Pnömokokenfeksiyonu Enflamasyonsuz enfeksiyon  Aplastik anemi, nötropenik ve disfonksiyonel nötrofiliklerde Pyojenik bakterilere dirençsizlik Kronik enfeksiyon  Kronik ishal yada büyüme bozukluğu olanlarda sIgA yada T hücre yetersizliği ♣ Rotavirus, G. lamblia enfeksiyonu

6. İMMUN YETERSİZLİĞE BAĞLI; HASTALIK BELİRTİLERİ Allerjik Artrit  Deri değişiklikleri • MALİGN HASTALIKLARLA İLGİLİ BELİRTİLER

7. b)FİZİKİ İNCELEME: • Hastada enfeksiyon bulunup bulunmadığı; VARSA;  Hastanın genel yanıtı, sağlık durumunun gözlenmesi • Hastalarda;  Solgunluk  Kanama odakları  Deride kolay morarma  Döküntü • Hastanın;  Lenf bezleri ve bademcikleri var olup olmadığı  Büyüklüğü saptanmalıdır  Ağır T hücre yetmezliğinde lenf bezi ele gelmez  Bademcikler görünmez

8. Normal bebeklerde dalağın alt ucu ele gelir  Ancak dalak yokluğu (aspleni ile) Bakteriyel (kapsüllü) enfeksiyonlar sıktır • Ağızda pamukçukların olması  T hücre yetersizliği  Candida sp • Bazı özel sendromlara spesifik;  Hastalık ve/veya bulguların olması Di George sendromunda  Neonatal tetanoz ve KKH  Wiskott-Aldrich sendromu  Egzama  Kolay kanama eğilimi  Peteşi

9. c)TANI TESTLERİ: • UYGUN TANI TESTİ NE DEMEK?  Hastanın kliniğine paralel doğru seçilmiş  Laboratuvar da özenle yapılmış  Sonucu titizlikle açıklanmış testtir

10. UYGUN TANI TESTİ İSTEMENİN NEDENLERİ İmmun sistem çevre ile dinamik bir dengede olduğu için;  Çoğu testin spektrumu geniştir  İmmunolojik testlerin BAZILARI; BİOASSAY (yaşam sürecinde inceleme) olduğundan  Test sırasında kontrol edilemeyen değişken faktörlerden etkilenirler  Bundan dolayı testler ♣Aynı yaş ve zamanda Hasta ve kontrol gruplarında yapılmalıdır

11. Bazı testler ilgili laboratuvarda az yapılır Bundan dolayı  Bu birim sürekli nitelik kontrolü yapması gerekir Test sonuçları  Klinik durumla paralel açıklanması gerekir ÇÜNKÜ;  Başka ikincil hastalıklar Veyametabolik bozukluklar sonuçları etkiler İmmunolojik testler  Özel araç- gereç ve uzman ekipmanlı laboratuvarlar gerektirdiğinden pahalıdır

13. IMMUNOLOJİK TESTLERDE KLİNİK ÖRNEKLER • Venöz damardan kan alınabilir • Mikrobiyal antijen tayini ile ilgili • Serum, dışkı, balgam, idrar, • Boğaz salgısı, BOS, PMNL • Diğer enfekte doku, salgı ve sekresyonlar • Humoral immuniteyle (antikor tayini) ilgili Serum (antikoagulansız kan) • Hücresel immuniteyle ilgili  Heparinlenmiş taze kan ve eriyik maddeler İnvivo uygulamalar (cilt testleri) • İmmuno genetik çalışmalarla ilgili Kan örnekleri Taze veya fikse edilmiş dokular

14. ENFEKSİYON HASTALIKLARININ TANISINDA • İmmunolojik (Serolojik) Testler ♦Enfeksiyon hastalığının tanısına sıklıkla indirekt, (bazende direkt) yardımcı olurlar ♦ Çeşitli klinik örneklerde mikroorganizmalara özgül antijen (Ag) veya antikorları (Ab) arama testleridir ♦ Ag araştıran testlerde duyarlılık erken ve tedavi edilmeyen durumlarda yüksektir ♦ Ab araştıran testlerde primer immun yanıt 7-21 gün içinde geliştiğinden çok erken evrede yalancı negatif olabilir ♦ Erken tedavi edilen ve bağışıklık yetmezliği olan olgularda antikor yanıtı gelişmemektedir

15. ♦ Bu testler Ag-Ab birleşme temelli testlerdir ♦ Bu testler duyarlılığı ve özgüllüğü farklı YÖNTEMLERLE invitro olarak yapılmaktadır ♦ Bu yöntemlerin ANALİTİK duyarlılığı farklıdır • Hücresel İmmun Yanıt (Fakültatif yada zorunlu H.İ.B) gelişir • İnvivo deri testleri • İnvitro sentezlenen Quanteferon miktarı ya da Quanteferon sentezleyen hücre miktarı ölçülür.

16. İmmunolojik yöntemlerin analitik duyarlılıkları (µg/ml- ng/ml)

17. Presipitasyon

18. MİKROBİYAL ENFEKSİYONLARDA SEROLOJİK(İMMUNOLOJİK) YÖNTEMLERİN AMACI(I) 1- TANIDA; • ÖRNEĞİN; VİRUSLARIN TANIMLANMASINDA; ♦ Kültürle izolasyonu; • Olanaksız, güç veya uzun zaman aldığından • örneğin HIV enf uygun hayvan yok • Tam donanımlı laboratuvarlar ve deneyimli elemanlar gerektirdiğinden • Virus izolasyonu için uygun örnek almak, transport etmek, saklamak hususlarındaki sorunlardan dolayı • RUTİN TANIDA PRATİK DEĞİLDİR

19. VİRUS ENFEKSİYONLARINDA SEROLOJİK(İMMUNOLOJİK) YÖNTEMLERİN AMACI(I) *Viruslerinmikroskobisinde; -EM ve inklüzyon cisimciği aranmasının pratikte kullanımı sınırlı, zahmetli ve pahalı olması -Subjektif değerlendirmelere (deneyimli eleman) açık olması, yalancı pozitiflik ve negatiflikler olabilir

20. VİRUS ENFEKSİYONLARINDA SEROLOJİK(İMMUNOLOJİK) YÖNTEMLERİN AMACI(I) ♦Viralnükleik asidin saptanmasında; -Moleküler Yöntemlerin *Her sağlık merkezinde uygulanamaması * Uygulandığı laboratuvarlara teknik donanım yetersizliği ve deneyimli ekipman azlığı * Her virus için deneysel olarak optimize edilememesi -Yalancı pozitif ve negatiflik sorunu * Her virus için uygulamasının olmaması - Özgül primer sorunu

21. Mikrobiyal Enfeksiyonlarda İmmunolojik (serolojik) Test Yöntemlerinin amacı; • ÖRNEĞİN; • BAKTERİYAL ETKENİN TANIMLANMASINDA • İzolasyonun olanaksız, güç veya zaman gerektirdiği durumlar; • Lepra, Sifiliz, Brucelloz, Tularemi • Derin yerleşimli bir enfeksiyonda örneği elde etmek veya üretmede zorluk; • Coxiella endokarditinde endokard örneği almak veya kanda üretme zorluğu • Legionella, Chlamydophila, atipik pnömosinde BAL yada NFS almak veya üretme zorluğu • Geçirilmiş bir enfeksiyon veya taşıyıcılık durum belirlemede: • ARA veya AGN’ de ASO düzeyi • Tifo’da Anti-Vi varlığı

22. MİKROBİYAL ENFEKSİYONLARDA ETKENİ TANIMLAMADA SEROLOJİK (İMMUNOLOJİK) DEĞERLENDİRME KRİTERLERİ (I) Antikor tayin temelli dört kriter vardır a)Tek bir serum örneğinde; Yüksek titrede spesifik IgMyanıtı -Rubella IgM, M.pneumoniae IgM  Veya IgM negatif IgG pozitif ise;  Akut-konvelasan dönem (2-3 hafta sonra) serumda 4 kat titre artışı -EBV IgG, C. pneumophila IgG ≥512 b)Akut ve konvelasan dönem (2-3 hafta) serumda 4 kat titreartışı Total antikor yanıtında  Paul Bunnel testi (EBV) Bruselloz tanısında Wright Testi  1/20den > 1/160 c) Nadir görülen enfeksiyonlarda;  Tek serum örneğinde Özgül IgM antikor yanıtı Kuduz, Botulismus

23. d)IgG AVİDİTE TESTLERİ AFİNİTE:Multivalan bir antikorun monovalan bir antijenle bağlanma kuvveti AVİDİTE:Multivalan bir antikorun multivalan bir antijenle bağlanma kuvveti

25. Primer ve sekonder enfeksiyon ayırımında kullanılır Olası Serolojik Profiller IgG (-) IgG (+) IgG (+) IgM (+) IgM (-) IgM (+)    Yeni Önceden Kazanılmış Geçirilmiş ve enfeksiyon Kazanılmış Bağışıklık

26. BU DURUM; • Re-enfeksiyonlarda • Toplumda yaygın dolaşan viruslar; • CMV, HSV gibi • Re-aktivasyonlarda • CMV, HSV, EBV, VZV gibi latent viruslar • Akut ve Subklinik Enfeksiyon Sonrası Uzamış SerokonversiyondaGÖRÜLEBİLİR • Toksoplazmoz

27. IgG AVİDİTE TESTLERİNDE PRENSİP (I) • Primer enfeksiyonlarda viruse özgül IgG aviditesi düşük; • Sekonder enfeksiyonlarda Yüksek • Re-enfeksiyon/aktivasyon • Primer enfeksiyonlarda oluşan antikorlar zaman ilerledikçe(>4 ay), olgunlaşır ve antijenlere bağlanma gücü artar • Bunun nedeni; • Yüksek aviditeli B lenfositlerin seçilmesindendir • İMMUNOKOMPETAN KİŞİLERDE AVİDİTE OLGUNLAŞMA SÜRELERİ • CMV  4 ay • RUBELLA  2 ay • TOXOPLASMA  6 ay • EBV  2.5 ay • HIV  6 – 12 ay

28. IgG AVİDİTE TESTLERİNDE PRENSİP (II) • Hamile kadınların; • CMV, Rubella konjenital enfeksiyonlarında; • Primer ve sekonder enfeksiyon ayrımında önemlidir • Enfeksiyon primerse konjenital geçiş yüksektir • Sekonder ise virusun geçişi düşüktür • Immunsuprese Olgularda • CMV, EBV ve HHV-6 enfeksiyonların primer yada sekonder ayrımında kullanılır

29. ETKENİ TANIMLAMADA ANTİJEN TAYİNİ: Duyarlılığı ve özgüllüğü yüksek tanı yöntemleriyle • Doğru yerden ve uygun şekilde alınan örneklerde Ag tayini • PMNH / pp65’in IF ile CMV tanısı • Serum örneklerinde HBsAg’nin EIA ile HBV tanısı • C.trachomatis Ag tayini ancak epitel hücre içeren üretral yada endoservikal sürüntü yada akıntı • H.pylori HpsA tayininde fazla sulu yada katı olmayan dışkı

30.  Ag Tayininin Yapıldığı Durumlar; • İzolasyonda(Kültür) sorunlar • Kültürde zor üreyen bakterilerin tanısında; • Örn: - C. trachomatis - L. pneumophila • Kültürü geciken yada uzun süren mikroorganizmaların tanısında; • Bakteriler - H.pylori • Viruslar - CMV/pp65 • Parazitler - E. granulosus • Mantarlar -C. neoformans

31. Kısa sürede, hızlı tanı konulması gereken ACİL-CİDDİ durumlarda; • Özellikle mikrobiyal menenjit tablosunda • Örn: S.agalactia yenidoğan menenjiti • Tonsillofarenjit • S.pyogenes • Toksijenik Ag’lerin tayini ile Bakteriyolojik Tanısında • C. difficile • Karışık ortamlardaki bakterilerin hızlı tanısında • Campylobacter • İndirekt bakteriyal tür tanısında • Shigella spp

32. Immunolojik(Serolojik) tanı neleri amaçlar?(II) 2. Enfeksiyon hastalığını doğrulama  Direkt Aglutinasyon Testi -Kültürde üreyen bakterinin antijenine karşı hasta serumundaki antikor yanıtının saptanması  M.tuberculosis enfeksiyonunda Quanteferon testi  HIV’ de EIA ile Anti- HIV’ in WB ile doğrulanması • Bir kişinin ya da toplumun bağışıklığını saptama Anti-HAV IgG,  Anti-HBs 4. Etkenlerin serogrup, serotip veya immunotiplendirilmesi E. coli’de ETEC, EPECgibi 5. Hastalığın prognozu  HAV IgM yanıtı,  HBV’de hepatitbelirteçleri

33. Serolojik(İmmunolojik) Tanıda Klinik Örnek Uygunluğu • Serum, plazma, plevra-periton-eklem sıvısı, BOS ve doku kesitleri • Ab Arama amaçlı serumun eldesi aseptik koşullarda olmalı ve Hemolizli,lipemik, fibrinliolmamalı • Ag Arama temelli klinik örnekler; CMV/ pp 65 PMNH bakılabilir RSV/Ag Nazofarengiyal yıkama suyu veya aspirat • Serolojik testler test kuralına göre çalışılmalı Örneğin:Soğuk aglütinasyon • Taze serumla çalışılmalı, Çalışılamıyorsa; Testlerin özelliğine göre 40C, -22, -40, -700C’ de saklanmalı • Serumlarda dondurma ve çözme işlemi bir kez yapılmalı • Bazı hastalıklarda kan alım aralığı önemli Örneğin:HIV’de ortalama 1.5 ay sonra

34. Serolojik Tanıda İnvitro Test PrensipleriIgG’nin moleküler yapısı

35. Antijen (Ag)- Antikor (Ab) birleşmesinin özellikleri • Antijen-antikor birleşmesi kimyasal bir reaksiyondur • Çünkü ısı açığa çıkar • Özgül bir reaksiyondur • S. flexneri‘ye karşı hazırlanan Ab • S. dysenteria ile birleşmez • Geriye dönüşür bir reaksiyondur • Ag+AbAgAb • Ag ile Ab arasında meydana gelen denge K ile gösterilen denge sabiti ile açıklanır • K=(AgAb) / (Ag) (Ab) • K ne kadar yüksek olursa birleşme o kadar özgüldür.

36. Antijen ve antikor uygun oranlarda biraraya getirildiğinde maksimum reaksiyon oluşur • İki safhalı reaksiyondur: 1. safha; -Çok kısadır, Gözle görülmez -Elektrolitlere gereksinim yoktur 2. safha; - Uzundur, gözle görülür. - Elektrolitlere gereksinim vardır. - Isı ve nötral pH reaksiyonu hızlandırır

37. Antijen-antikor birleşmesinde rol oynayan kuvvetler 1- Elektrostatik kuvvetler - Ag ve Ab moleküllerinin yüzeyinde birbirine zıt yüklü yapıların birbirini çekmesidir - Bu hücrelerdeki çekme gücü 2 molekül arasındaki uzaklığın karesi ile ters orantılıdır. F=(1/d2) -Bu kuvvetler Ag ve Ab birbirine yaklaştıkça artar - Örneğin NH+ grubu ise iyonize COO- grupları birbirine çeker. 2-     Hidrojen bağları -Hidrofilik gruplar arasında meydana gelen bağlardır -Zayıf ve geriye dönüşümlü bağlardır -Bu bağların oluşmasında iki molekülün birbirine yaklaşması gerekmektedir.

38. 3-     Hidrofobik bağlar - Bu bağlar 2 molekülün birbirine yaklaşması sırasında su moleküllerini iterek birleşmesinde etkendir 4-     Van der Walls kuvvetleri - Bu kuvvetler Ag ve Ab molekülünü saran elektron bulutları ile ilgili kuvvetlerdir. - Bu kuvvetlerin etkinliği için Ag ve Ab moleküllerinin birbirine çok yaklaşmaları gerekir. - Bu kuvvetlerin etkinliği Ag ve Ab arasındaki uzaklığı 7 ile ters orantılıdır  F=1/d7

39. SEROLOJİK TEST YÖNTEMLERİ1)PRESİPİTASYON; • Çözünür haldeki antijen ve özgül antikorların  Optimum konsantrasyonda karıştırılması ve  Birleşmesine bağlı gelişen reaksiyona denir  Reaksiyon sonucu  Kompleks (presipitat)gözle görülür  Birkaç dakikadan,1-2 güne kadar uzayabilir • Reaksiyonda  Optimum Ag ve Ab miktarı önemlidir AYRICA;  PH, elektrolit ve ısı da önemlidir

40. Presipitasyon reaksiyonları; Pasif difüzyon şeklinde  Sıvı ortamda difüzyon  Halka ve kapiller tüp N. menengitidis, S. pneumoniae, H.influenzae Ag Jel (agar)ortamda difüzyon Tek yönlü difüzyon Quidin tüp dif.  Çeşitlivirus ve bakteri Ag belirlenmesinde kullanılır Radyal, Mancini plak dif.  CRP, serum Ig ve kompleman düzeyleri ♣Türbidimetrik ve nefolometrik cihazlar geliştirilmiştir ♣ Çok sayıda kan değerlendirilmesi için Çift yönlü (quchterlonoy plak) difüzyon Aspergilloz, histoplasmoz, blastomikoz Ag’lerin belirlenmesinde Immuno-double diffusion

41. ■ ELEKTRO- İMMUN DİFÜZYON Elektrikli ortamda;  Antijenler elektriksel alanda ayrılırlar (elektroforez)  Elektroforez için değişik matriksler;  Kağıt  Sellüloz asetat  Agar  Poliakrilamid kullanılır  İmmun difüzyon ve elektroforezin birleştirilmiş tekniğine İMMUNELEKTROFOREZ denir Serum proteinlerinin tanımlanmasında Ig sınıfları ve ağır, hafif zincirlerdeki anormalliklerin saptanmasında  Basit, tek yönlü (laurell)(roket elektroforezi) ♣Titresi bilinmeyen bir antijenin titresini belirler  Karşıt( zıt yönlü) IEF ♣HBVAg ve Ab saptanmasında ♣Septik menenjit, pnömoni, septik artrit vb etken Antijen saptanmasında

42. 2) AGLUTİNASYON: • Doğal olarak antijen taşıyan Bakteriler, Eritrositler, Lökositler • Yüzeylerinde yapay olarak antijen bulunan  Eritrosit, Latex, Bentonit  Polistren gibi sentetik parçacıkların  Elektrolitli bir ortamda Taşıdıkları antijenlerle,  Spesifik antikorların ♣Kümeleşme yaparak çökmesine denir • Lamda, tüpte mikroplaklarda yapılırlar • İkiye ayrılır  Aktif aglutinasyon  Pasif aglutinasyon

43. AKTİF AGLUTİNASYON; DİREKT  Aglutinasyonda rol alan antijen partikülün kendisidir  Bakterilerin antijenleri Gruber- Widal, Wright, WF  Kan grubu antijenleri  Aktif hemaglutinasyon ♣ABO, Rh, Vd  Forward  Reverse ♣Cross-Matching  Major  Minor ♣Soğuk aglutinasyon  M.pneumoniae ♣Paul- Bunnel EBV

44. AKTİF AGLUTİNASYON; İNDİREKT  Antijen ve antikorun bağlanmasında ikincil bir antikorun kullanılması  Antiglobulin Ab (tavşan kaynaklı - ticari) Direk Coombs ♣ Eritroblostasis fetalisli çocukların eritrosit yüzeyindeki Ab saptanır İndirekt Coombs ♣ Rh (-) annenin serumdaki Anti-Rh Ab’ler saptanır

45. Reaksiyon güçlendiriciler A H G (Anti Human Globülin)

47. PASİF AGLUTİNASYON • ANTİKOR (Ab) ARANIYORSA  Aglutinasyonda rol alan antijenler  Polisakkarit veya Proteinler (tannik asitle)  Eritrosite bağlanırsa ♣HEMAGLUTİNASYON VZV, Rubella, CMV, T.gondii Latex partikülleri, bentonit, kömür vb

48. PASİF AGLUTİNASYON • ANTİJEN (Ag) (TERS PASİF) ARANIYORSA;  Eritrosit, latex, bentonit, kömür S.aureus covan 1 Antikorun Fc’sine bağlanır Latex Agg (LA) Ko Agg (CoA) ♣ Serum, BOS, idrarda  Bakteriyal polisakkarit Ag’leri N.menengitidis Hib S.pneumoniae C.neoformans Streptokokgruplandırılması, S.aureuskoagulaz deneyi  Çeşitli bakteri ve virusta ag tayinleri

49. Hemaglutinasyon- inhibisyon (HI) testi Hemaglutinasyonu engelleyici antikorların saptandığı testtir  Hastanın serumu seri dilusyon edilir  Üzerine standardize sabit virus antijeni konulur Eritrositler eklenir  Serumda Ab’ler varsa  Hemaglutinasyonun görülmediği son titre pozitif sonuçtur İnfluenzae, Kabakulak, Rubella enfeksiyonlarında

50. 3)KOMPLEMAN BAĞLAMA TESTİ • Antijen ve antikor birleşmesinin komplemanı uyarmasına dayanarak geliştirilen iki basamaklı testtir • Antikor (sıklıkla) ve antijen saptayabilen yarı kantitatif bir yöntemdir • Test birbirinden farklı üç komponent içerir Test sistemi  Hasta serumu (inaktif/aranan Ab)  Antijen (bilinen) KOMPLEMAN(kobay veya tavşan serum) İndikatör sistemi (hemolitik sistem)  Koyun eritrositleri  Koyun eritrositlerine karşı Ab