Coltura Cellulare

1. Coltura Cellulare ?Insieme di cellule mantenute “in vitro”, derivanti dalla disgregazione di tessuti o isolate da fluidi biologici come il sangue. ?Le cellule vengono poste a contatto di tutti i fattori e metaboliti necessari alla loro crescita.

4. Tecniche Sterili o Asettiche Per impedire la contaminazione accidentale dovuta a microbi provenienti da fonti esterne Per impedire la contaminazione di se stessi o di terzi

5. Metodi di Sterilizzazione Sterilizzazione al calore rosso su fiamma Sterilizzazione al calore secco mediante l’utilizzo di un forno ad una temperatura di circa 160°C per almeno 2 h. Particolarmente indicata per la vetreria di laboratorio Sterilizzazione al calore umido mediante l’utilizzo dell’autoclave a 121 °C per almeno 15 min. Particolarmente indicata per emzzi liquidi non sensibili al calore e per la vetreia di laboratorio dopo l’uso

6. Laboratorio di Coltura Cellulare Spazio o area di lavoro Abbigliamento da laboratorio Reagenti colturali Vetreria e Plastica di laboratorio Cappa a flusso laminare

7. CAPPA A FLUSSO LAMINARE Flusso laminare: flusso unidirezionale formato da filetti di aria sterile, filtrata attraverso filtri HEPA, paralleli tra loro ed aventi tutti la stessa velocità, generalmente di 0,5 m/sec. I filetti di aria sterile trascinano lontano dall’area di lavoro i contaminanti ed evitano la formazioni di vortici. Filtri HEPA(High Efficiency Particulate Air): prevengono la contaminazione particellare, sono costituiti da fogli di microfibre di vetro ripiegati più volte per aumentare la superficie filtrante; l’efficienza è la capacità di trattenere particelle di 0,3 micron di diametro e deve essere compresa tra 99,97% e 99,99%. Le cappe a flusso laminare garantiscono principalmente la protezione del campione da contaminazioni non la protezione dell’operatore e dell’ambiente

10. ?Cappe biologiche di classe II: maggiormente impiegate in laboratori di ricerca e microbiologici, sono anche definite cappe di sicurezza microbiologica ?Cappe biologiche di classe III: caratterizzate da una chiusura totale ermetica, funzionano a pressione negativa; le manipolazioni all’interno della camera sono consentite da due o più guanti di gomma incorporati nella struttura della cappa. I campioni, in contenitori chiusi, sono introdotti tramite un sistema di doppi sportelli. Hanno un filtro HEPA sull’aria in ingresso ed un doppio filtro HEPA sull’aria in uscita -Protezione totale dell’operatore e dell’ambiente. -Manipolazioni ad alto rischio biologico

15. Relazione tra [NaHCO3] e il pH

16. ? In alcuni casi si può incorporare nel medium di crescita un colorante sensibile al pH per avere un controllo visivo dello stato del pH durante la crescita. Condizioni fisico-chimiche

19. Sospensione Cellulare Mista Approcci per separare i diversi tipi cellulari: ?proprietà fisiche ?capacità di adesione ?proprietà di legame con anticorpi specifici ?uso di terreni o condizioni di coltura selettivi

20. Tipi di Coltura di Cellule “in vitro” Coltura Primaria Coltura Secondaria

23. ?Isolamento di ceppi clonali: il programma genetico della senescenza è stato annullato attraverso mutazioni spontanee o indotte ? Derivazione: da colture primarie di tumori o da manipolazioni genetiche di colture primarie non tumorali Le cellule trasformate presentano caratteristiche simili alle cellule cancerose Vantaggi: cellule (clonali) più facili da coltivare, risposte riproducibili con risultati meno variabili delle colture primarie Svantaggi: non riproducono esattamente l’ambiente fisiologico cellulare

25. Coltura Primaria Coltura a breve termine Coltura a lungo termine < 10 duplicazioni 50-60 duplicazioni

26. Coltura Secondaria Linea Cellulare Continua >150-200 duplicazioni

27. Linea Cellulare Continua Capacità di crescere indipendentemente dall’organismo da cui è derivata Crescita ininterrotta per oltre un anno Immortale

28. Le prime Linee Cellulari Continue 1952, Johns Hopkins University

29. Medium di Coltura ?I terreni base disponibili in commercio contengono tutti i componenti nutritivi necessari alla crescita delle cellule ?I più comuni terreni base di coltura: -MEM: Minimum Essential Medium -DMEM: Dulbecco’s modification of MEM -RPMI: Roswell Park Memorial Institute Differiscono per la concentrazione in amminoacidi e sali e per la concentrazione di glucosio

34. Medium di Coltura Il terreno base viene conservato a 4°C e, prima di essere utilizzato, viene complementato con: Glutammina (aa essenziale molto labile) Antibiotici (penicillina/streptomicina) Siero (supplemento più comune delle colture cellulari)

35. SIERO Miscela complessa di proteine ed elementi fondamentali per la crescita in vitro della maggior parte delle cellule Fattori di crescita: PDGF, EGF, IGF Fattori di adesione: fibronectina, vitronectina Altri elementi: trasferrina, albumina, colesterolo, acidi grassi e glucorticoidi, elementi minerali Il siero di uso più comune è il siero fetale di bovino (FBS)

38. Distacco delle cellule in adesione Soluzione di EDTA e tripsina -EDTA: chela il Ca2+ e il Mg 2+, indispensabili per l’adesione -Tripsina: enzima proteolitico, derivato da pancreas porcino. Degrada le proteine della matrice che mantengono le cellule aderenti al substrato

41. Plastica per coltura Sono generalmente in polistirene: -materiale rigido con superficie lucida -buona resistenza chimica a soluzioni acquose -limitata resistenza a solventi -totale assenza di tossicità per le cellule in coltura -trasparenza che consente una osservazione diretta al microscopio -la superficie è trattata chimicamente per renderla idrofila e carica negativamente (per favorire i legami stabili con i fattori di adesione presenti nel siero)

42. Efficienza di semina -Generalmente le cellule, al di sotto di una certa densità non crescono in modo efficiente -Regola generale: densità > 104 cellule/cm2

49. Conta Cellulare Diversi metodi: un metodo semplice ed economico è l’uso dell’emocitometro o camera di Burker -La camera è costituita da un vetro in cui è ricavata una camera capillare; la parte superiore della camera è costituita da un vetrino bloccato lateralmente.

50. Procedura per Conta Cellulare Preparare la sospensione cellulare Trasferire una piccola quantità di sospensione cellulare nella camera del vetrino, permettendo il riempimento per capillarità Contare le cellule nel quadrato centrale e nei quattro quadrati agli angoli Ciascun quadrato ha un volume di 0.1mm3