Coltura Cellulare

1. Coltura Cellulare ?Insieme di cellule mantenute �in vitro�, derivanti dalla disgregazione di tessuti o isolate da fluidi biologici come il sangue. ?Le cellule vengono poste a contatto di tutti i fattori e metaboliti necessari alla loro crescita.

4. Tecniche Sterili o Asettiche Per impedire la contaminazione accidentale dovuta a microbi provenienti da fonti esterne Per impedire la contaminazione di se stessi o di terzi

5. Metodi di Sterilizzazione Sterilizzazione al calore rosso su fiamma Sterilizzazione al calore secco mediante l�utilizzo di un forno ad una temperatura di circa 160�C per almeno 2 h. Particolarmente indicata per la vetreria di laboratorio Sterilizzazione al calore umido mediante l�utilizzo dell�autoclave a 121 �C per almeno 15 min. Particolarmente indicata per emzzi liquidi non sensibili al calore e per la vetreia di laboratorio dopo l�uso

6. Laboratorio di Coltura Cellulare Spazio o area di lavoro Abbigliamento da laboratorio Reagenti colturali Vetreria e Plastica di laboratorio Cappa a flusso laminare

7. CAPPA A FLUSSO LAMINARE Flusso laminare: flusso unidirezionale formato da filetti di aria sterile, filtrata attraverso filtri HEPA, paralleli tra loro ed aventi tutti la stessa velocit�, generalmente di 0,5 m/sec. I filetti di aria sterile trascinano lontano dall�area di lavoro i contaminanti ed evitano la formazioni di vortici. Filtri HEPA(High Efficiency Particulate Air): prevengono la contaminazione particellare, sono costituiti da fogli di microfibre di vetro ripiegati pi� volte per aumentare la superficie filtrante; l�efficienza � la capacit� di trattenere particelle di 0,3 micron di diametro e deve essere compresa tra 99,97% e 99,99%. Le cappe a flusso laminare garantiscono principalmente la protezione del campione da contaminazioni non la protezione dell�operatore e dell�ambiente

10. ?Cappe biologiche di classe II: maggiormente impiegate in laboratori di ricerca e microbiologici, sono anche definite cappe di sicurezza microbiologica ?Cappe biologiche di classe III: caratterizzate da una chiusura totale ermetica, funzionano a pressione negativa; le manipolazioni all�interno della camera sono consentite da due o pi� guanti di gomma incorporati nella struttura della cappa. I campioni, in contenitori chiusi, sono introdotti tramite un sistema di doppi sportelli. Hanno un filtro HEPA sull�aria in ingresso ed un doppio filtro HEPA sull�aria in uscita -Protezione totale dell�operatore e dell�ambiente. -Manipolazioni ad alto rischio biologico

15. Relazione tra [NaHCO3] e il pH

16. ? In alcuni casi si pu� incorporare nel medium di crescita un colorante sensibile al pH per avere un controllo visivo dello stato del pH durante la crescita. Condizioni fisico-chimiche

19. Sospensione Cellulare Mista Approcci per separare i diversi tipi cellulari: ?propriet� fisiche ?capacit� di adesione ?propriet� di legame con anticorpi specifici ?uso di terreni o condizioni di coltura selettivi

20. Tipi di Coltura di Cellule �in vitro� Coltura Primaria Coltura Secondaria

23. ?Isolamento di ceppi clonali: il programma genetico della senescenza � stato annullato attraverso mutazioni spontanee o indotte ? Derivazione: da colture primarie di tumori o da manipolazioni genetiche di colture primarie non tumorali Le cellule trasformate presentano caratteristiche simili alle cellule cancerose Vantaggi: cellule (clonali) pi� facili da coltivare, risposte riproducibili con risultati meno variabili delle colture primarie Svantaggi: non riproducono esattamente l�ambiente fisiologico cellulare

25. Coltura Primaria Coltura a breve termine Coltura a lungo termine < 10 duplicazioni 50-60 duplicazioni

26. Coltura Secondaria Linea Cellulare Continua >150-200 duplicazioni

27. Linea Cellulare Continua Capacit� di crescere indipendentemente dall�organismo da cui � derivata Crescita ininterrotta per oltre un anno Immortale

28. Le prime Linee Cellulari Continue 1952, Johns Hopkins University

29. Medium di Coltura ?I terreni base disponibili in commercio contengono tutti i componenti nutritivi necessari alla crescita delle cellule ?I pi� comuni terreni base di coltura: -MEM: Minimum Essential Medium -DMEM: Dulbecco�s modification of MEM -RPMI: Roswell Park Memorial Institute Differiscono per la concentrazione in amminoacidi e sali e per la concentrazione di glucosio

34. Medium di Coltura Il terreno base viene conservato a 4�C e, prima di essere utilizzato, viene complementato con: Glutammina (aa essenziale molto labile) Antibiotici (penicillina/streptomicina) Siero (supplemento pi� comune delle colture cellulari)

35. SIERO Miscela complessa di proteine ed elementi fondamentali per la crescita in vitro della maggior parte delle cellule Fattori di crescita: PDGF, EGF, IGF Fattori di adesione: fibronectina, vitronectina Altri elementi: trasferrina, albumina, colesterolo, acidi grassi e glucorticoidi, elementi minerali Il siero di uso pi� comune � il siero fetale di bovino (FBS)

38. Distacco delle cellule in adesione Soluzione di EDTA e tripsina -EDTA: chela il Ca2+ e il Mg 2+, indispensabili per l�adesione -Tripsina: enzima proteolitico, derivato da pancreas porcino. Degrada le proteine della matrice che mantengono le cellule aderenti al substrato

41. Plastica per coltura Sono generalmente in polistirene: -materiale rigido con superficie lucida -buona resistenza chimica a soluzioni acquose -limitata resistenza a solventi -totale assenza di tossicit� per le cellule in coltura -trasparenza che consente una osservazione diretta al microscopio -la superficie � trattata chimicamente per renderla idrofila e carica negativamente (per favorire i legami stabili con i fattori di adesione presenti nel siero)

42. Efficienza di semina -Generalmente le cellule, al di sotto di una certa densit� non crescono in modo efficiente -Regola generale: densit� > 104 cellule/cm2

49. Conta Cellulare Diversi metodi: un metodo semplice ed economico � l�uso dell�emocitometro o camera di Burker -La camera � costituita da un vetro in cui � ricavata una camera capillare; la parte superiore della camera � costituita da un vetrino bloccato lateralmente.

50. Procedura per Conta Cellulare Preparare la sospensione cellulare Trasferire una piccola quantit� di sospensione cellulare nella camera del vetrino, permettendo il riempimento per capillarit� Contare le cellule nel quadrato centrale e nei quattro quadrati agli angoli Ciascun quadrato ha un volume di 0.1mm3