TERRENO DI COLTURA

1. TERRENO DI COLTURA Miscela di composti biologici o sintetici, organici o minerali, capace di fornire un ambiente ottimale per la crescita di un particolare tipo di microrganismo

2. TERRENI DI COLTURA • I microrganismi vivono in natura in popolazioni che sono dette miste, costituite da un’ampia varietà di differenti tipi di microbi. I microrganismi necessitano di ambienti favorevoli e di sostanze nutritive adatte. Il terreno di coltura deve contenere principi nutritivi essenziali per lo sviluppo di una coltura microbica e deve fornire condizioni ambientali adatte alla crescita, vale a dire condizioni ottimali di: pH, pressione osmotica, ossigeno atmosferico,ecc.

3. TIPI DI TERRENI • TERRENI COMPLESSI: non si conosce la loro esatta composizione chimica; sono i più comunemente usati; x es.: Brodo Comune, Brodo di Malto, MRS. • TERRENI DEFINITI o SINTETICI: si conosce l’esatta composizione chimica; formato da composti chimici puri, aggiunti a concentrazione nota. • TERRENI SELETTIVI o DI ARRICCHIMENTO: terreni di coltura aventi una combinazione di nutrienti che in combinazione con opportune condizioni fisiche permettono l’isolamento di SPECIFICI microrganismi (x es. con l’uso di antibiotici)

4. TERRENI DI COLTURA • Nutrient Broth • Nutrient Agar • peptone 5 g • estratto di carne 1 g • estratto di lievito 2 g • sodio cloruro 5 g • acqua dist. 1000 ml • Sospendere i componenti in acqua dist. fredda poco a poco per evitare la formazione di grumi, agitare e portare all'ebollizione fino a completa soluzione. Aggiustare il pH fino a 7,4. • Sterilizzare in autoclave.

5. X BATTERIX LIEVITI E MUFFE • De Man Rogosa Sharpe (MRS) per LATTOBACILLI • Peptone from casein 10.0g; • meat extract 8.0g; • yeast extract 4.0g; • D(+)-glucose 20.0g; • dipotassium hydrogen phosphate 2.0g; • Tween® 80 1.0g; • di-ammonium hydrogen citrate 2.0g; • sodium acetate 5.0g; • magnesium sulfate 0.2g; • manganese sulfate 0.04g; • agar-agar (not present in MRS broth) 14.0g • acqua dist. 1000 ml

6. TERRENI DI COLTURA • LIQUIDI: sono chiamati BRODI (BROTH) • SOLIDI: contengono AGAR. • agar • - È un polisaccaride contenente zolfo estratto da un’alga marina. Reperibile in commercio in forma essiccata pura. Si disidrata facilmente. Ci sono vari tipi di agar che hanno proprietà fisiche diverse. • - Non è un nutriente, ma utilizzato come agente solidificante nei terreni di coltura. • Dal punto di vista chimico è un galattano, carboidrato complesso formato da molecole di galattosio. • - Liquefazione a 97/100°C; solidificazione a 42/ 45°C • I terreni agarizzati possono essere incubati a tutte le temperature. • Possono essere anche utilizzate gelatina o gel di silice

7. CRESCITA IN SUBSTRATI LIQUIDI • Se il terreno è liquido la crescita può dar luogo a: 1) Intorbidamento 2) Formazione di una pellicola 3) Sedimento (lievito) 4)Mucosità

8. INGLOBAMENTO O INCLUSIONE • Il terreno viene seminato mentre è ancora liquido

9. I microrganismi ad occhi nudo: crescita in substrati liquidi

10. I MICRORGANISMI AD OCCHIO NUDO:CRESCITA IN SUBSTRATI SOLIDI ( SLANT) • L’agar inclinato è una provetta di terreno a base di agar che viene posta obliqua durante il raffreddamento e si presta per essere seminata con l’ansa o con l’ago. Sono più facilmente osservabili le colture che producono pigmento

11. I MICRORGANISMI AD OCCHIO NUDO:CRESCITA IN SUBSTRATI SOLIDI (SLANT)

12. LA SEMINA DEI TERRENI DI COLTURA • SEMINA DI TERRENO SOLIDO • SPATOLAMENTO

13. STRISCIO

14. I MICRORGANISMI AD OCCHIO NUDO:CRESCITA IN SUBSTRATI SOLIDI (PIASTRE DI PETRI) Se si aggiunge una sostanza solidificante ad un brodo che contiene cellule batteriche, si verificherà che queste rimangono intrappolate ciascuna al proprio posto invece di galleggiare (terreno liquido) e , moltiplicandosi produrrano una massa visibile di cellule, detta COLONIA.

15. I MICRORGANISMI AD OCCHIO NUDO:CRESCITA IN SUBSTRATI SOLIDI (PIASTRE DI PETRI) • Se le cellule si raggruppano ad una certa distanza, ciascuna sarà in grado di sopravvivere e genererà una colonia isolata. Colonie di microrganismi diversi differiscono per misura, colore e struttura.Per questo motivo l’aspetto di una colonia è importante per l’identificazione di una coltura.

16. I MICRORGANISMI AD OCCHIO NUDO:CRESCITA IN SUBSTRATI SOLIDI (PIASTRE DI PETRI) • TECNICA DELLA STRISCIATA SU PIASTRA • Si può trasferire una coltura microbica sulla superficie dell’agar di una piastra petri con l’ansa o con l’ago incurvato; questa tecnica viene chiamata di trasferimento per striscio ed una piastra così preparata viene detta strisciata. Esistono varie tecniche di striscio su piastra. Attenzione! Bisogna flambare e far lasciare raffreddare l’ago o l’ansa ad ogni passaggio. • L’obiettivo della tecnica dello striscio è quella di formare da una sospensione di cellule, delle colonie ben separate.

17. All’inizio di una striscio le cellule sono strettamente compatte, ma con il proseguire lo striscio le cellule rimangono sempre meno sull’ago, trasferendosi sempre più distanziate sull’agar formando colonie sempre più separate. • Poche strisciate frettolose non producono colonie separate; una buona piastra è il risultato di molti movimenti continui dell’ansa o dell’ago. Si inizia con una goccia di coltura sul bordo della piastra. • In una delle tecniche si sterilizza alla fiamma l’ago per lo striscio o l’ansa e si raffredda sul bordo dell’agar. Si tiene sempre semicoperta la piastra di petri. La goccia deve essere opposta a voi e strisciate verso di voi

18. CONCETTO DI STERILITÀ • STERILIZZAZIONE: distruzione di ogni organismo vivente, (comprese le endospore di Bacillus e Clostridium). • DEVE essere assoluta In un laboratorio di microbiologia. Nelle industrie alimentari è un concetto statistico (tempi di riduzione decimale). • Il più usato ed efficace strumento per sterilizzare è il CALORE • PERCHÉ? Perché le proteine denaturano • Lo strumento principale di sterilizzazione in microbiologia è: • L’AUTOCLAVE: sterilizza attraverso il vapore sotto pressione (assai più efficace del CALORE secco)

19. L’AUTOCLAVE • sovrapressione di 1atm = 121°C; tempo di 15 minuti • il vapore deve poter entrare in contatto con le soluzioni (tappi di cotone; bottiglie aperte) • P/T minori e tempi maggiori per limitare il danno ai composti organici (imbrunimento, caramellizzazione) • N.B.: Molti zuccheri e gli antibiotici devono essere sterilizzati per filtrazione

20. LAVORARE IN STERILITÀ • Pipette • Ansa • Spatola • Becco Bunsen • Si lavora con fiamma ossidante (azzurra, più calda, più stabile), • NON riducente (gialla)

21. Tutti i terreni di coltura dovrebbero essere controllati prima dell'uso per contaminazione e data di scadenza. • L’area iniziale di semina deve ricoprire una superficie compresa fra un terzo ed un quarto dell’area complessiva dell’agar utilizzato. Possono essere utilizzate in funzione delle circostanze piastre intere, a metà od a quattro settori. I campioni devono essere seminati per ottenere colonie isolate, o diffusi direttamente su un intera porzione di una piastra e posti ad incubare senza successiva diffusione del materiale.

22. Le anse metalliche devono essere flambate portando la loro estremità nella parte inferiore della fiamma di un Bunsen fino a che l’intera ansa non assume colore rosso per il calore. Riporle a raffreddare su un supporto prima del loro utilizzo. Ciò può essere eseguito prima e dopo il loro utilizzo e fra la semina di piastre di agar. • E’ consuetudine utilizzare due anse per consentire un adeguato raffreddamento di ciascuna dopo la flambatura mentre si sta utilizzando l’altra ansa. Possono essere utilizzate per ciascuna piastra anse monouso diverse. Le anse di metallo devono essere riscaldate con la fiamma di un Bunsen con la parte terminale dell’ansa rivolta verso basso fino ad arroventarsi, poi rimosse e lasciate raffreddare. • Tutti i terreni devono essere incubati il più presto possibile. La piastre per l’incubazione anaerobica devono essere incubate il più presto possibile per prevenire la perdita di vitalità

23. TECNICA ASETTICA • Quando si manipolano campioni o culture, la tecnica asettica risulta importante per evitare la loro contaminazione e proteggere chi lavora da infezione proveniente dal campione. • Se il lavoro viene svolto su un banco aperto, uno sterilizzatore Bunsen dovrebbe essere collocato in stretta prossimità per flambare le anse o i fili metallici. • · Quando si aprono i contenitori delle culture mantenere il campioni lontano dal viso

24. INCUBAZIONE DEI MICRORGANISMI • I brodi o i terreni agarizzati seminati devono essere posti ad una TEMPERATURA, per un TEMPO e nelle CONDIZIONI ottimali per permettere la crescita del microrganismo con sui si sta lavorando • Esempi: • Bacillus stearothermophilus • G+, anaerobio facoltativo, termofilo • Bifidobacterium bifidum • G+, anaerobio stretto, mesofilo • Incubazione a 60°C per 8-12 h Incubazione a 37°C per 36-48 h • Le piastre vanno incubate in posizione capovolta. • Scrivere nome, data e tipo di contenuto