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核酸的生物合成

核酸的生物合成. 本章重点介绍遗传中心法则和 DNA 、 RNA 的生物合成，对基因工程作一般介绍。. DNA 是绝大多数生物体遗传信息的载体，继 1953 年 Watson & Crick 提出 DNA 双螺旋结构模型后， 1958 年， Crick 提出了“ 中心法则 ” (Central dogma) 揭示了遗传信息的传递规律。. 思考 . 返回. 复制. DNA. 转录. 逆转录. 蛋白质. RNA. 翻译. 复制. 遗传信息传递的 中心法则.

Thomas
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核酸的生物合成

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  1. 核酸的生物合成 本章重点介绍遗传中心法则和DNA、RNA的生物合成，对基因工程作一般介绍。 DNA是绝大多数生物体遗传信息的载体，继1953年Watson & Crick提出DNA双螺旋结构模型后，1958年，Crick提出了“中心法则”(Central dogma)揭示了遗传信息的传递规律。 思考 返回

  2. 复制 DNA 转录 逆转录 蛋白质 RNA 翻译 复制 遗传信息传递的 中心法则 生物的遗传信息以密码的形式储存在DNA分子上，表现为特定的核苷酸排列顺序。在细胞分裂的过程中，通过DNA复制把亲代细胞所含的遗传信息忠实地传递给两个子代细胞。在子代细胞的生长发育过程中，这些遗传信息通过转录传递给RNA，再由RNA通过翻译转变成相应的蛋白质多肽链上的氨基酸排列顺序，由蛋白质执行各种各样的生物学功能，使后代表现出与亲代相似的遗传特征。后来人们又发现，在宿主细胞中一些RNA病毒能以自己的RNA为模板复制出新的病毒RNA，还有一些RNA病毒能以其RNA为模板合成DNA，称为逆转录这是中心法则的补充。 中心法则总结了生物体内遗传信息的流动规律，揭示遗传的分子基础，不仅使人们对细胞的生长、发育、遗传、变异等生命现象有了更深刻的认识，而且以这方面的理论和技术为基础发展了基因工程，给人类的生产和生活带来了深刻的革命。

  3. 目 录 第一节 DNA的生物合成 第二节 RNA的生物合成 第三节 核酸合成的抑制剂 第四节 基因工程及分子生物学技术简介

  4. 第一节 DNA的生物合成 一、DNA的复制（DNA指导下的DNA合成） 二、逆转录作用（RNA指导下的DNA的合成） 三、DNA突变 四、 DNA的损伤与修复

  5. 一、DNA的半保留复制 1、概念和实验依据 2、原核生物DNA聚合反应有关的酶类 3、原核细胞DNA的复制的起始点和方式 4、原核细胞DNA的复制过程（半不连续复制） 5、DNA复制的忠实性 6、真核细胞DNA的复制

  6. DNA的半保留复制的概念 DNA在复制时，两条链解开分别作为模板，在DNA聚合酶的催化下按碱基互补的原则合成两条与模板链互补的新链，以组成新的DNA分子。这样新形成的两个DNA分子与亲代DNA分子的碱基顺序完全一样。由于子代DNA分子中一条链来自亲代，另一条链是新合成的，这种复制方式称为半保留复制。

  7. 3´ 5´ 解旋酶 解链酶 引物酶和引发体 SSB RNA引物 DNA聚合酶III DNA聚合酶I 3´ 3´ 5´ 5´ RNA引物 原核生物DNA聚合反应有关的酶类 （1）DNA聚合酶(DNA polymetases) （2）引物酶(peimase)和引发体(primosome)：启动RNA引物链的合成。 (3） DNA连接酶（DNA ligase） （4）DNA解链酶(DNA helicase) (5）单链结合蛋白(single-strand binding protein,SSB)：结合在解开的DNA单链上，防止重新形成双螺旋。 (6）拓扑异构酶(topoisomerase):兼具内切酶和连接酶活力，能迅速将DNA超螺旋或双螺旋紧张状态变成松驰状态，便于解链。

  8. 复制的忠实性 DNA复制过程是一个高度精确的过程，据估计，大肠杆菌DNA复制109-1010碱基对仅出现一个误差，保证复制忠实性的原因主要有以下三点: a、DNA聚合酶的高度专一性（严格遵循 碱基配对原则） b、DNA聚合酶的校对功能（错配碱基被3’-5’ 外切酶切除） c、起始时以RNA作为引物

  9. [15N] DNA DNA的半保留复制实验依据 [14N- 15N] DNA 1958年Meselson & stahl用同位素示踪标记加密度梯度离心技术实验,证明了DNA是采取半保留的方式进行复制. [14N- 15N] DNA [14N] DNA

  10. ATP或NAD＋ PPi或NMN 5' 3' 模板链 连接酶连接切口 A G T G A A C C T T C T G G T A A C 5' 3' P P P P P P P P P OH 缺口 连接酶 Mg2+ 3' 5' 模板链 A G T G A A C C T T C T G G T A A C P P P P P P P P P 5' 3'

  11. DnaA蛋白结合位点 四个9bp序列 成串排列的 三个13bp序列 共有序列 共有序列 GATCTNTTNTTT TTATCCACA SSB DnaA DnaB (解螺旋酶) 大肠杆菌DNA复制起点在起始阶段的结构模型 大肠杆菌复制起点成串排列的重复序列

  12. 起始点 起始点 起始点 起始点 复制叉的推进 环状DNA复制时所形成的θ结构 复制叉 DNA复制的方式 未复制DNA 单向复制 复制叉 双向复制 复制叉

  13. 解旋酶 解链酶 引物体 SSB 复制的起始 RNA引物 DNA聚合酶III DNA链的合成与延长 DNA连接酶 DNA聚合酶I DNA链合成的终止 随后链 3´ 3´ 3´ 5´ 前导链 RNA引物 5´ 3´ 复制叉的移动方向 原核细胞DNA的半不连续复制复制过程 3´ 5´

  14. 核心酶  延长因子     Pol III  DNA聚合酶Ⅲ二聚体    Pol III DNA聚合酶Ⅲ全酶

  15. 3´ 3´ 5´ 5´ 3´ 5´ 5´ 3´ 模板链 3´ 5´ 3´ 5´ RNA引物 DNA聚合酶催化的链延长反应 子链

  16. 大肠杆菌三种DNA聚合酶比较 DNA 聚合酶Ⅰ DNA 聚合酶Ⅱ DNA聚合酶Ⅲ （复合物） 比较项目 109，000 400 + + + 1 400，000 10-20 + + + 50 分子量 每个细胞的分子统计数 5´-3 ´聚合酶作用 3´-5 ´核酸外切酶作用 5´-3 ´核酸外切酶作用 转化率 120，000 100 + + - 0 .05

  17. 错配碱基 5´ 3´ 5´ 3´ 3´- 5´核酸外切酶水解位点 DNA聚合酶的3- 5外切酶水解位点

  18. 解旋酶 引物体 解旋酶 引物体 引物 聚合酶III全酶 引物 聚合酶III全酶 复制叉处前导链和随后链同时合成的工作模型

  19. 5´-核酸外切酶 聚合中心 3´-核酸外切酶 裂缝内部 裂缝 DNA聚合酶的校对功能

  20. DNA聚合酶的校对功能 切除错配核苷酸 错配硷基 正 确核苷酸 聚合酶 复制方向 3´ 5´ 3´ 5´ 3´ 5´

  21. 起点 起点 起点 起点 起点 起点 真核细胞DNA复制的特点  多个起点复制  端粒（telemere）复制

  22. C AAAACCCCAAAACCC C C A 5´ 3´ 端粒酶（telomerase） DNA复制需要引物，但在线形DNA分子末端不可能通过正常的机制在引物被降解后合成相应的片段.如果没有特殊的机制合成末端序列，染色体就会在细胞传代中变得越来越短。这一难题是通过端粒酶的发现才得到了澄清，端粒酶是一种含RNA的蛋白复合物，实质上是一种逆转录酶，它能催化互补于RNA模板的DNA片段的合成，使复制以后的线形DNA分子的末端保持不变。 初步研究表明，人体中生殖细胞的端粒长度保持不变，而体细胞的端粒长度则随个体的老化而逐步缩短。对此的一个推论是：人的生殖细胞具端粒酶的活力，体细胞则否。这一问题的解决无疑会有助于对生命衰老的认识。 端粒酶

  23. 端粒合成的完成 TTTTGGGGTTTTG 3´ 5´ 5´ AA 3´ TTTTGGGG TTTTGGGG TTTTGGGGTTTT C AAAACCCCAAAACCC n C C 3´ A AA 5´ 3´ TTTTGGGGTTTTGGGGTTTTG 5´ TTTTGGGG TTTTGGGG TTTTGGGGT n TT 5´ 3´ 3´ AA CCCCT AA 3´ C AAAACCCCAAAACCC 5´ C C TTTTGGGG TTTTGGGG TTTTGGGGT A TT 5´ 3´ 3´ AAAACCCC AAAACCCC AAAACCCCT n 移位和再杂交 T T TGGG TGGG 3´ AA TTTTG 5´ GTTTTG 进一步加工 C AAAACCCCAAAACCC C C A 继续延伸 5´ 3´ 端粒合成的一种模型 整合和杂交

  24. 真核和原核DNA细胞复制比较

  25. 以RNA为模板合成DNA，这与通常转录过程中遗传信息从DNA到RNA的方向相反，故称为逆转录作用。以RNA为模板合成DNA，这与通常转录过程中遗传信息从DNA到RNA的方向相反，故称为逆转录作用。 依赖RNA的DNA聚合酶活力 核糖核酸酶H活力 依赖DNA指导下的DNA聚合酶活力 二、逆 转 录 作 用 1、概念 2、逆转录酶 三种功能 3、病毒逆转录过程 • 扩充了中心法则 • 有助于对病毒致癌机制的了解 • 与真核细胞分裂和胚胎发育有关 • 逆转录酶是分子生物学重要工具酶 4、逆转录的生物学意义

  26. 依赖RNA的DNA聚合酶 核糖核酸酶H活力 依赖DNA的DNA聚合酶 逆转录过程中cDNA的合成

  27. 整合入宿主细胞染色体DNA 逆逆转录病毒的生活周期生活周期 cDNA 转录 逆转录 RNA 转译 RNA RNA 衣壳蛋白 丢失衣壳 被膜 进入细胞 被膜蛋白 丢失被膜 逆转录酶 衣壳 逆转录酶

  28. 三、DNA的突变 DNA分子中的核苷酸序列发生突然而稳定的改变，从而导致DNA的复制以及后来的转录和翻译产物随之发生变化，表现出异常的遗传特性，称为DNA的突变。它包括由于DNA损伤和错配得不到修复而引起的突变，以及由于不同DNA分子之间的交换而引起的遗传重组。 一、突变的类型 碱基对的置换(substitution) 移码突变(framesshift mutation) 二、诱变剂的作用 碱基类似物(base analog) 碱基修饰剂(base modifier) 嵌入染料(intercalation dye) 紫外线(ultraviolet)和电离辐射(ionizing radiation)

  29. -T-C-G-A-C-T-G-T-A-C-G- -A-G-C-T-G-A-C-A-T-G-C- 转换 颠换 -T-C-G-T-C-T-G-T-A-C-G- -A-G-C-A-G-A-C-A-T-G-C- -T-C-G-G-C-T-G-T-A-C-G- -A-G-C-C-G-A-C-A-T-G-C- A 插入 缺失 -T-C-G-A-G-C-T-G-T-A-C-G- -A-G-C-T-C-G-A-C-A-T-G-C- -T-C-G-C-T-G-T-A-C-G- -A-G-C-G-A-C-A-T-G-C- T 野生型基因 DNA突变的类型 碱基对的置换(substitution) 移码突变 (framesshift mutation)

  30. 四、DNA的损伤与修复 某些物理化学因子，如紫外线、电离辐射和化学诱变剂等，都有引起生物突变和致死的作用，其机理是作用于DNA，造成DNA结构和功能的破坏，称为DNA的损伤. DNA的修复主要有以下类型: （1）光裂合酶修复活 （2）切除修复 （3）重组修复 暗修复 （4）诱导修复（SOS修复）

  31. DNA紫外线损伤的光裂合酶修复 1、形成嘧啶二聚体 2、光复合酶结合于 损伤部位 3、酶被可见光激活 4、修复后酶被释放

  32. DNA的损伤和切除修复 结构缺陷 碱基丢失 碱基缺陷或错配 糖苷酶 切开 切开 核酸内切酶 AP核酸内切酶 切除 切除 核酸外切酶 核酸外切酶 碱基取代 插入酶 修复 DNA聚合酶 连接 DNA连接酶

  33. DNA的重组修复 胸腺嘧啶二聚体 复制 修复复制 重组 DNA聚合酶 核酸酶及重组蛋白 DNA连接酶

  34. 单链DNA ATP SOS反应的机制 未诱导的细胞 LexA(阻遏物) RecA(辅蛋白酶) 靶基因 lexA基因被LexA 蛋白质部分阻遏 recA基因被LexA 蛋白质部分阻遏 （40个不同的位点被阻遏） 诱导的细胞 RecA促使分解LexA recA大量表达 靶基因表达 lexA靶基因表达 但产物被分解

  35. 第二节RNA的生物合成 一、DNA指导下RNA的合成（转录） 二、 RNA指导下RNA的合成(RNA的复制) 三、RNA和DNA合成比较

  36. 一、DNA指导下RNA的合成（转录） 1、概念及DNA的有义链和反义链 2、RNA聚合酶及催化反应 3、RNA合成过程 4、RNA转录后的加工 5、真核生物的RNA合成

  37. 转录的概念和DNA的有义链和反义链 转录是在 DNA的指导下的RNA聚合酶的催化下，按照硷基配对的原则，以四种核苷酸为原料合成一条与模板DNA互补的RNA的过程。RNA的转录从DNA模板的特定位点开始，并在一定的位点终止。此转录区域为一个转录单位。 模板链（templatte strand） 反意义链(antisense strand) 启动子（promoter) 终止子(terminator) DNA 5´ 3´ 3´ 5´ 有意义链(sense strand) 非信息区

  38. 大肠杆菌RNA聚合酶的结构示意图     起始因子 核心酶(α2ββ) 全酶(αββ ) β——和模板DNA结合 β——起始和催化聚合反应 α——？

  39. 3´ 5´ RNA聚合酶催化的反应 U 5´ A G C C G A U 3´ 新合成RNA 模板DNA

  40. 启动子（promoter) 终止子(terminator)     RNA聚合酶 5 离开 3    5 3 3 5 5 5 3 5 RNA合成过程 起始 双链DNA局部解开 磷酸二酯键形成 延长阶段 解链区到达基因终点 终止阶段 RNA

  41. 模板链（反义链） 有义链 解链 复链 3´ RNA-DNA杂交螺旋 新生RNA 聚合酶的移动方向 延长部位 3´ RNA链的延伸图解

  42. 原核生物中rRNA前体的加工 30S前体 甲基化作用 专一核酸内切酶 17S 25S tRNA 专一核酸外切酶 专一核酸外切酶 16S rRNA tRNA 23S rRNA 5S rRNA

  43. tRNA前体分子的加工 a、切除tRNA前体两端多余的序列： 5’—端切除几到10个核苷酸。 RNAaseF RNAaseF RNAaseP RNAaseP RNAaseD ACC RNAaseD b、末端添加：3’-端添加CCA序列。  c、修饰：形成稀有碱基如DH2 。   表示核酸内切酶的作用 表示核酸外切酶的作用 表示核苷酸转移酶的作用 表示异构化酶的作用

  44. m7G-5´ppp-N-3 ´ p 真核细胞mRNA的加工  5′端接上一个“帽子”(CAP)结构 3′端添加PolyA“尾巴”,由RNA末端核苷酸转移酶催化  剪接：剪去内含子(intron)，拼接外显子(extron) 顺反子(cistron ) 5´“帽子” PolyA3´ AAAAAAA-OH

  45. 加工 成熟tRNA 早转录本 酵母酪氨酸tRNA前体的加工

  46. 真核生物和原核生物转录的差别 真核生物中转录与复制在不同的区域 RNA聚合酶不相同  启动子不同  转录后RNA加工修饰不同 DNA mRNA前体 加工 mRNA 核 mRNA 转运 核糖体 新生蛋白质 原核生物 真核生物

  47. A. 负链的合成 噬菌体Q的合成 病毒的正链 复制中间体 新合成的负链 B. 正链的合成 负链 复制中间体 新合成的正链

  48. 第三节 核酸合成的抑制剂 核苷酸合成抑制剂 氨基酸类似物 叶酸类似物 碱基和核苷酸类似物 与DNA模板结合的抑制剂 嵌合剂 烷化剂 作用于DNA聚合酶或RNA集合酶的抑制剂 抗菌素:如利福平、曲张霉素 有机化合物：如磷羧基乙酸

  49. 第四节 基因工程及分子生物学 技术简介 一、基因工程 二、体细胞克隆技术 三、聚合酶键式反应（polymerase chain reaction, PCR）

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