ETEROCROMATIZZAZIONE COME MECCANISMO REGOLATIVO ES.= GENI OMEOTICI DI D. melanogaster .

1. ETEROCROMATIZZAZIONE COME MECCANISMO REGOLATIVO ES.= GENI OMEOTICI DI D. melanogaster.

2. Geni Omeotici: Complesso Antennapedia Il fenotipo mutante in questi geni è quello in cui si sviluppano le zampe al posto delle antenne

3. Geni Omeotici: Complesso Bithorax Il fenotipo mutante in questi geni è quello di un doppio torace

4. Proteine del gruppo Polycomb e Tritorax • PcG e Trx sono regolatori dei Geni Omeotici. Mutazioni in PcG comportano • l’espressione di ANT e BX anche in tessuti dove di solitosono repressi. • Queste proteine forniscono un modello chiave per il mantenimento • degli stati cromatinici legati all’espressione genica. • PcG e Trx mantengono i pattern spaziali dell’espressione dei geni Hox, • che vengono stabiliti inizialmente nell’embrione precoce a carico • dei geni della segmentazione. • In stadi più avanzati dell’embriogenesi, i geni della segmentazione • decadono e PcG e Trx assumono il controllo. • In generale: • PcG sono repressori e mantengono lo stato “off” • Trx sono attivatori e mantengono la trascrizione, cioè lo stato “on”

5. Recentemente è stato mostrato il coinvolgimento delle proteine dei gruppi • PcG e Trx anche in altri processi: • proliferazione cellulare • identità di cellule staminali • cancro • inprinting genomico nelle piante e nei mammiferi • inattivazione del cromosoma X

6. COMPLESSI PcG E TrxG PcG Drosophila Uomo PRC2 E(z) EZH2 Esc EED Su(var)12 SUZ12 N55 RpAp48 RpAp46 PRC1 dRING RING1A Pc HPC1-3 Ph HPH1-3 Psc BMI1 Scm SCMH1-2 Fattori associati a TBP PhoRC dSfmbt ? Pho ? TrxG Drosophila Uomo SWI/SNF Brm BRM Osa BAF250 Moira BAF170 Snr1 BAF47 NURF Iswi SNF2L N38 ? N301 BPTF N55 RpAp46 RpAp48 TAC1 Trx dCBP SBF1 Ash1 Ash1 dCBP MLL1-3 MLL1-3 WRD5 ASH2L RbBP5 CF1P Geni ortologhi

7. Il reclutamento di PcG e TrxG coinvolge segnali combinatoriali. Varie proteine reclutano i complessi su PRE/TRE in maniera indipendente dallo stato di attivazione del gene. Un segnale specifico dello sviluppo determina se il gene debba essere attivato o represso H3K27me3 associata a deubiquitinazione di H2B H3K4me3 associata a ubiquitinazione di H2B

8. Complessi PCR2: Tri-metilazione di H3K27 Si localizzano sulle regioni trimetilate in K27, nelle mosche, in topo e nell’uomo. Complessi Trx: Tri-metilazione di H3K4 Si localizzano sulle regioni più attive del genoma e arricchite in H3K4me3 • UBX • Componenti di entrambi i gruppi interagiscono con elementi di sequenza • PRE = Polycomb response element • Nello stato represso l’intero gene è trimetilato in H3K27 • Nello stato attivo questo segnale è presente in regioni a monte ma assente dal • promotore e dalle regioni codificanti. • Nello stato attivo questo conduce al legame di Ash1 che induce immediata • trimetilazione di H3K4.

9. Trimetilazione di K27 interferisce con met di K4 e ubiquitinazione di H2B. Forse ncRNAs partecipano al processo. Tipico di organismi che non hanno PCR1, tipo le piante. K27me3 e PRC1 si espandono a partire da un PRE fino a un promotore vicino. Interferiscono con i complessi attivanti come SWI/SNF. dRING ubiquitina H2B, segnale negativo Promotori lontani possono essere silenziati in concomitanza con altri attraverso formazione di loop.

10. Il cromosoma X inattivo si distingue da quello attivo per molte caratteristiche: • Distribuzione non casuale di varianti istoniche • Modificazioni istoniche covalenti • Ritardo della replicazione in fase S • Associazione in cis con trascritti specifici per Xi (XIST). Questa è anche l’unica • caratteristica esclusiva del cromosoma Xi, mentre le altre sono comuni anche • ad altre frazioni eterocromatiche

11. Eterocromatina di Xi: H3K9me2 + H3K27me3 segnali acquisiti durante l’inattivazione EZH2 = human HMTase (omologa dell’enzima di Drosophila): è responsabile della metilazione di K27. Non si conoscono ancora le metilasi specifiche per la dimetilazione di K9 su Xi. HP1 è fortemente arricchito su Xi. HP1 però lega normalmente H3K9me3 in vivo. Esistono quindi su Xi caratteristiche comuni alla cromatina pericentrica della cui formazione HP1 è responsabile tramite il legame con H3K9me3?

12. Cellule RPE1 Cellule HME1 • In due linee cellulari diverse la forma H3K9me3 (verde) è presente • Questa e H3K27me3 (rosso) non sono distribuite casualmente • Altre evidenze: • Le bande arricchite in H3K27me3 presentano anche alti livelli di • macroH2A (un’altra variante di H2A esclusiva del Xi). Questo sembra • correlato con la presenza di una più alta densità nucleosomale. • Esistono due tipi distinti di eterocromatina sul Xi, di cui solo quella che • presenta H3K9me2 ha anche la caratteristica della replicazione • tardiva. • Analisi sul corpo di Barr (quindi in interfase) mostrano che H3K9me3 • e H3K27me3 occupano territori distinti. • L’RNA XIST si associa chiaramente con H3K27me3 e non con H3K9me3. • Il territorio XIST/H3K27me3 è definito anche dalla presenza di macroH2A. • HP1 è presente ad alti livelli e associata a H3K9me3 + H4K20me3.

13. Modello proposto per due tipi di eterocromatina giustapposti lungo il cromosoma X inattivo I due territori sono chiaramente separati, sia sul cromosoma metafasico (bandeggio) sia sul corpo di Barr (interfase) e sono caratterizzati da differenti combinazioni di modificazioni istoniche e proteine associate. XIST RNA + H3K27me3+ macroH2A HP1 + H3K9me3 + H4K20me3

15. Telomeri • Alle estremità dei cromosomi • Assicurano la Stabilità • Prevengono la degradazione delle estremità • Bloccano la fusione delle estremità cromosomali

16. Le strutture telomeriche sono evidenziabili alle estremità di tutti i cromosomi eucariotici, usando tecniche di fluorescenza.

17. SEQUENZE TELOMERICHE RIPETITIVE NEGLI EUCARIOTI

18. In lievito le regioni subtelomeriche sono ricche in sequenze medio-lunghe • ripetute un numero variabile di volte a seconda del ceppo. • Gli elementi X si trovano in tutti i telomeri si S. cerevisiae • Gli elementi Y’ possono essere presenti in numero da 0 a 4. • Questi elementi si muovono per ricombinazione e contribuiscono alla • conservazione delle estremità. • In lievito mutanti est1- sono letali a causa dell’estremo accorciamento • dei telomeri, ma possono essere recuperati tramite multiple inserzioni di • elementi Y’.

19. I telomeri sono regioni estremamente resistenti alle nucleasi, quindi • hanno una struttura cromatinica praticamente inaccessibile. • Questo è dovuto alla presenza di numerosi complessi proteici che • ricoprono svariate funzioni telomeriche. • Fattori che regolano la lunghezza dei telomeri, che hanno forti • omologie nei lieviti e nell’uomo. • Fattori che si occupano del riparo del DNA e sono in grado di distinguere • estremità sane da estremità rotte. Questi sono legati anche ai macchinari • di replicazione. • Fattori che si associano alla telomerasi (sia nei lieviti che nell’uomo) • e la coadiuvano nelle sue funzioni.

20. Nei lieviti il mantenimento della giusta lunghezza è assicurato dalla continua azione della Telomerasi Questa è in grado di comunicare con alcune proteine che ricoprono le sequenze ripetute Rap1 Rif1/2 Ku70/Ku80 La proteina Rap1 (POT1 nell’uomo) è effettivamente in grado di “contare” il numero di sequenze presenti e attivare o meno la telomerasi tramite proteine che comunicano con la telomerasi (Cdc13 in lievito, Pot1 nell’uomo) e si trovano proprio associate ad essa.

21. Proteine telomeriche in diversi organismi

22. Modello del T-Loop in telomeri umani mediato da TRF1 e POT1

23. Modello del T-loop: Proteine coinvolte

24. ETEROCROMATINA TELOMERICA E DOMINI SUBTELOMERICI I domini HAST e HZAD contengono geni a basso tasso di espressione, in condizioni di crescita normali. Vengono attivati in condizioni di crescita sfavorevoli. Nucleosomi che contengono Htz1

25. ETEROCROMATINA TELOMERICA Caratteristica generale: assenza di acetilazione e/o metilazione sui nucleosomi. L’attività deacetilasica principale è SIR2. • Specificità di SIR2: • H4K16 • H3 ed altri siti di H4 quando si trova nel complesso con SIR3 e SIR4 Se l’eterocromatina è disassemblata H3K4 e H3K79 vengono metilate, ma tale segnale sparisce con la riformazione dello stato eterocromatico. K4me viene rimosso attivamente K79me viene diluito con i cicli replicativi

26. Modello Multi-Step per la formazione dell’eterocromatina telomerica Rap1: centro di nucleazione della cromatina telomerica. Primo elemento reclutato da Rap1 è Sir4. Sir4 stabilizza la struttura legando Sir3 e Sir2 • L’estensione della eterocromatina • dipende da: • presenza del complesso SIR intatto • attività deacetilasica di Sir2 • presenza di istoni H3 e H4 deacetilati • Deacetilazione di H4K16 è • fondamentale per il legame di Sir3 • Acetilazione di H4K16 da parte di Sas2 • nell’eucromatina adiacente blocca • l’espansione dell’eterocromatina

27. HAST = Hda1-affected subtelomeric domain • Si trovano a ~10-25Kb dall’estremità cromosomale. • I geni in HAST non sono silenziati dalla eterocromatina telomerica. • Sono attivati in condizioni avverse. • Acetilazione di H4 e H2A simile a geni eucromatici. • Acetilazione di H2B ridotta e di H3 fortemente ridotta. • Hda1 è la deacetilasi che funziona su questi domini, ed è specifica per H3 e H2B. Questo stato perziale di acetilazione potrebbe favorire un certo grado di repressione, rendendo però ancora facile l’induzione genica in condizioni di stress

28. HZAD = Htz1 activated domains Geni regolati tramite l’uso della variante istonica Htz1. Htz1 è di solito associata con promotori inattivi dove facilita l’attivazione. In alcuni casi questi domini si sovrappongono agli HAST, anche se sono più piccoli. Htz1 è presente sia nel promotore che nella regione codificante, caratteristica unica dei domini HZAD. Forte ipoacetilazione di H3K18,23 (forse a carico di Hda1) nel promotore. Maggiore acetilazione in quasi tutti i siti di H3 nella regione codificante. Nucleosomi che contengono Htz1