Identificazione di geni nei mammiferi

1. Identificazione di geni nei mammiferi by N.A.

2. Studiare un genoma • Studiare un genoma significa : • clonare le sue sequenze, • ordinare i cloni per ricomporre l’organizzazione spaziale delle sequenze • comprendere l’architettura del genoma identificando i diversi tipi di DNA e la loro distribuzione • identificare i geni e la loro funzione • studiarne l’evoluzione attraverso il confronto con altri genomi by N.A.

3. Dalla genetica alla genomica: timeline di una“evoluzione concettuale” by N.A.

4. 1865 - 1944 Da Mendel al DNA by N.A.

5. 1866: le leggi di Mendel Per la prima volta è indagato scientificamente il problema della trasmissione dei caratteri: Mendel scopre le leggi dell’ereditarietà. Mendel, G. “Versuche über Pflanzen-Hybriden”in “Verhandlungen des naturforschenden Vereines, Abhandlungen Brünn“,4, 3-47, (1866). • Gli individui possono essere selezionati e incrociati scientificamente, ma non c’è ancora una spiegazione molecolare del fenomeno... by N.A.

6. La biochimica 1869: Miescher per la prima volta isola una sostanza che chiama nucleina perchè abbondante nel nucleo cellulare e scrive l’articolo “La composizione chimica delle cellule del pus”. Più tardi la nucleina, caratterizzata chimicamente, si dimostrerà un acido, le cui componenti sono desossiribosio, fosfati e basi azotate. La sostanza è ribattezzata DNA. Miescher, F. "Ueber die chemische Zusammensetzung der Eiterzellen”, Hoppe-Seyler's medicinisch-chemische Untersuchungen,4, 441-460, (1871). by N.A.

7. La citologia 1903: Sutton propone la teoria cromosomica dell’ereditarietà, correlando il comportamento in meiosi dei cromosomi scoperti da Flemming nel 1882 con le modalità di trasmissione dei caratteri mendeliani. La teoria sarà dimostrata da Morgan nel 1910 con studi in Drosophila. Sutton, W. “The chromosomes in heredity”, Biological Bulletin, 4, 231-251, (1903). by N.A.

8. Il principio trasformante : il DNA 1944: Avery, McCarty e MacLeod identificano nel DNA la molecola della informazione ereditaria: costituisce il “principio trasformante” che rende lisce le colonie di batteri a colonie rugose. Avery, O.T., MacLeod, C.M. and McCarty, M. “Studies on the chemical nature of the substance inducing transformation of pneumococcal types”, J. Exp. Med., 79, 137-158, (1944). by N.A.

9. 1953 - 1984 Da Watson e Cric all’idea del sequenziamento by N.A.

10. La doppia elica 1953: Watson e Crick propongono il modello a doppia elica per la molecola del DNA. Watson, J.D. & Crick, F.H.C. “A structure for deoxyribose nucleic acid”. Nature, 171, 737 - 738, (1953). • Base molecolare nota. • Informazione illeggibile! by N.A.

11. Il codice genetico U C A G U U U U C C C C A A A A U G G G G C A G 1966: Nirenberg, Khorana e Holley determinano il codice genetico -> a ogni tripletta corrisponde un amminoacido e viceversa (... quasi). In questo stadio della genetica è più facile sequenziare le proteine e dalla successione degli aminoacidi dedurre la sequenza nucleotidica. by N.A.

12. Tappe 1974: Ed Southern mette a punto la tecnica che prendera’ il suo nome: il Southern Blot. Lastra sviluppata dopo esposizione del filtro ottenuto dopo trasferimento e ibridazione con sonda marcata radioattivamente(P32) DNA genomico digerito caricato su gel con EtBr 1968: purificazione del primo enzima di restrizione. 1969: le università americane si collegano ad ARPANET, l’antenato di INTERNET 1973: mappa di restrizione di SV40 e clonaggio del primo plasmide by N.A.

13. Tappe 1977: Gilbert e Sanger inventano un sistema per sequenziare “rapidamente” una molecola di DNA. Si determinano alcune decine bp/mese uomo (mu). 1983: grazie alle nuove sonde e agli RFLP viene mappato per linkage il locus della Corea di Huntington. Si apre la possibilita’ di mappare geneticamente anche quegli organismi non accessibili dalla genetica classica basata sugli incroci e si puo’ fare il linkage utilizzando “il fenotipo” del DNA 1985: Mullis concepisce la PCR (polymerase chain reaction) 1986:Hood realizza il primo sequenziamento automatico (-> Mb/mu) 1988:Vengono costruiti gli YAC che possono contenere fino a 2Mb by N.A.

14. Tappe : gli STS 2 1 mappa fisica: contiguo DNA genomico H F* A* C A+,B-,C+.. Q B* H F Q A C B D G D G* A-,B+,C+.. B+,D+,G+ Clonaggio mappa genetica: A, G e F sono in linkage il loro ordine e’ F-A-G H+,F+,T-.. F+,T-,Q+.. screening library con PCR Sequenziamento GACTTAG........CATAGCA ~200bp H F Q A C B D G I due contigui sono sullo stesso cromosoma e via cosi.... scelta dei primers x A,B,C.. 1989: L’automazione del sequenziamento permette di sequenziare corte sequenze (~200pb) clonate a caso da cui ricavare primers per “screenare” con la PCR ormai automatizzata le librerie e costruire mappe fisiche attraverso la creazione di contigui . Quando sono polimorfiche sono marcatori comuni alle mappe sia genetiche che fisiche e permettono di legarle fra loro STS A,B,C.. by N.A.

15. Tappe 1992: I BAC:possibilita’ di clonare frammenti molto grandi (fino a 200Kb) e stabili a differenza degli YAC. 1994: I PAC possono sopportare frammenti genomici piu’ piccoli (fino a 100-120Kb) 1998: Gli SNPs: nuova generazione di polimorfismi del DNA: sono sostituzioni di singole basi, con frequenza ogni poche centinaia di basi, sono stati individuati grazie all’automazione del sequenziamento, permetteranno di generare mappe genetiche ad alta densita’ by N.A.

16. Studiare un genoma • Studiare un genoma significa : • clonare le sue sequenze, • ordinare i cloni per ricomporre l’organizzazione spaziale delle sequenze • comprendere l’architettura del genoma identificando i diversi tipi di DNA e la loro distribuzione • identificare i geni e la loro funzione • studiarne l’evoluzione attraverso il confronto con altri genomi by N.A.

17. Come identificare i geni Analisi al computer Informazioni cliniche Informazioni di laboratorio A1:Omologo animale mappato? B1:regione cromosomica candidata? C1:raccolta famiglie per mappatura D1:mappatura genetica: ricerca genomica E1:trovata la localizzazione? SI NO SI NO SI NO E2: errore nel tipo di eredita’ o eterogeneita’ genetica C2:delezioni o traslocazioni cromosomiche D2:clonaggio dei punti di rottura A2:Omologo animale clonato? B2:Verifica nei database dei geni della regione D3:nuovi geni umani identificati E3:ripensare ai geni candidati: vai A2,A3,D3 A3:Ricerca nei database genetici B3:Possibile gene candidato? D4:struttura genomica e sequenza completa NO B4:e’ stato completamente caratterizzato? NO E5:trovate mutazioni patogene? C5:Raccolta pazienti non imparentati D5:Ricerca delle mutazioni SI TROVATO!!! SI by N.A.

18. Strategie • CLONAGGIO FUNZIONALE: le basi biochimiche della funzione in studio sono note. Utile in pochi casi • CLONAGGIO POSIZIONALE: si conosce solo la localizzazione cromosomica del locus. Richiede la costruzione di una mappa fisica e genetica della regione. • STRATEGIE CON GENE CANDIDATO INDIPENDENTI DALLA LOCALIZZAZIONE: e’ necessario correlare il fenotipo a modelli animali o porre in relazione il fenotipo a famiglie geniche gia’ note • STRATEGIE CON GENE CANDIDATO CONOSCENDO LA LOCALIZZAZIONE: sono quelle attualmente piu’ utilizzate, soprattutto per la possibilita’ di utilizzare le banche dati. by N.A.

19. Attenzione Le strategie sono alternative, la scelta dipende dalle informazioni di partenza , ma ovviamente nel corso dello studio si integrano: praticamente alla fine si usano tutte. Non esiste quella giusta in assoluto esiste quella che mi puo’ dare maggiori risultati nelle condizioni sperimentali in cui mi trovo ad operare by N.A.

20. Studiare un genoma • Studiare un genoma significa : • clonare le sue sequenze, • ordinare i cloni per ricomporre l’organizzazione spaziale delle sequenze • comprendere l’architettura del genoma identificando i diversi tipi di DNA e la loro distribuzione • identificare i geni e la loro funzione • studiarne l’evoluzione attraverso il confronto con altri genomi Bisogna avere delle mappe collegate fra loro perche’ una sola non basta: by N.A.

21. Tipi di mappe: mappe fisiche La sequenza clonata e’ il gene che sto cercando? • Mappe fisiche: sono come le mappe geografiche. Descrivono la posizione fisica dei cloni di una libreria genomica uno relativamente all’altro sulla base della loro sequenza • Se riesco ad allinearle con le mappe genetiche posso collegare un gruppo di cloni a un locus e cominciare a rispondere alla domanda ultima di tutto il lavoro: by N.A.

22. Tipi di mappe: mappe genetiche La sequenza clonata e’ il gene che sto cercando? • Mappe genetiche : si basano sulla frequenza di ricombinazione fra locus identificati attraverso marcatori di varia natura: fenotipo dell’ individuo, fenotipo tissutale, fenotipo cellulare, fenotipo proteico, fenotipo del DNA. • Sono la connessione fra una realta’ biologica e il genoma corrispondente, senza di loro spesso non si puo’ procedere, non si puo’ rispondere alla domanda ultima di tutto il lavoro: by N.A.

23. Tipi di mappe: mappe di espressione La sequenza clonata e’ il gene che sto cercando? • Mappe di espressione: ordinano all’interno di una regione gli RNA espressi. • Il DNA codificante costituisce una frazione del DNA di un organismo quindi e’ necessario collegare le mappe fisiche e genetiche a una mappa di espressione per evitare di concentrarsi su sequenze non idonee a rispondere alla domanda ultima di tutto il lavoro: by N.A.

24. Le mappe fisiche • Mappe fisiche: sono come le mappe geografiche. Descrivono la posizione fisica dei cloni di una libreria genomica uno relativamente all’altro sulla base della loro sequenza • Ne esistono di diversi tipi che forniscono informazioni complementari: • mappe da ibridi di cellule somatiche e da radiazione, • mappe di restrizione a lungo raggio • mappe basate su cloni utilizzando STS e EST • mappe ottenute con FISH by N.A.

25. Le mappe fisiche • Mappe fisiche: sono come le mappe geografiche. Descrivono la posizione fisica dei cloni di una libreria genomica uno relativamente all’altro sulla base della loro sequenza • Ne esistono di diversi tipi che forniscono informazioni complementari: • mappe da ibridi di cellule somatiche e da radiazione, Si originano dalla fusione in vitro del genoma di due specie e dalla susseguente origine di una linea cellulare che contiene nel suo nucleo i cromosomi della linea accetrice e alcuni cromosomi o parti di essi della donatrice by N.A.

26. Creazione degli ibridi somatici Accettrice Donatrice X X X X X X +PEG X X X X X X Eterocarionte binucleato X X X Selezione X X X Sincarionte .::. .::. .::. .::. .::. X X X Ibrido X by N.A.

27. Pannello di RH per il crom.5 caratterizzato con STS STS RH by N.A.

28. Tipi di mappe: mappe genetiche • Mappe genetiche : si basano sulla frequenza di ricombinazione fra locus identificati attraverso marcatori di varia natura: fenotipo dell’ individuo, fenotipo tissutale, fenotipo cellulare, fenotipo proteico, fenotipo del DNA. • Sono la connessione fra una realta’ biologica e il genoma corrispondente, senza di loro spesso non si puo’ procedere, by N.A.

29. Le mappe genetiche • Si basano sugli studi di linkage cioe’ sull’analisi della segregazione alla meiosi di marcatori genetici. • Se due o piu’ marcatori vengono ereditati preferenzialmente nelle combinazioni parentali si deduce che mappino nella stessa regione genomica • Ricordate? L’unita’ di mappa e’ il centimorgan(cM): 1cM indica che due locus ricombinano fra loro con una frequenza pari a 0.01. Si assume che 1cM sia pari a ~1.5Mb anche se la relazione diretta non c’e’: la mappa genetica puo’ essere piu’ lunga di quella fisica. by N.A.

30. Linkage:fase di piu locus 6 5 2 6 2 2 7 5 4 6 6 2 6 5 2 6 2 2 2 5 2 5 5 5 1 4 1 3 7 5 2 2 1 9 5 5 7 4 4 2 5 4 2 5 2 6 2 2 1 4 1 3 7 5 8 6 3 2 1 8 2 2 1 9 5 5 3 6 5 5 7 8 6 5 2 6 2 2 2 2 1 9 5 8 6 5 2 6 2 2 2 2 1 6 2 2 8 6 3 2 1 8 6 5 2 6 2 2 7 5 4 6 6 2 6 5 2 6 2 2 3 6 5 5 7 8 7 4 4 2 5 4 • Definizione della regione candidata con analisi di linkage: ricostruzione degli aplotipi studiando la segregazione nelle famiglie. E’ necessario risalire alla fase e identificare i ricombinanti 8 3 8 2 7 10 10 4 6 4 1 6 8 3 8 2 7 10 10 3 2 3 5 8 8 3 8 2 7 10 5 3 5 3 1 7 8 3 8 4 2 3 10 3 2 3 5 8 • Possedere un particolare polimorfismo non vuol dire avere il fenotipo, lo studio di linkage e’ a livello di popolazione, serve ad individuare una regione non la mutazione by N.A.

31. Polimorfismo • Variazione presente nella popolazione con una frequenza superiore a 1% Variazioni nell’aspetto by N.A.

32. Polimorfismo • Variazione presente nella popolazione con una frequenza superiore a 1% Polimorfismi proteici • Polimorfismi del DNA: di restrizione (RFLP), minisatellite, microsatellite. Individuabili con southern blotting o PCR by N.A.

33. La connessione fra mappe Quindi si hanno due tipi di mappe: fisica e genetica. Il problema e’ trovare il modo di legarle: la mappa fisica mi dice in che un gruppo di sequenze formano un contiguo su un frammento di cromosoma, ma non mi permette di identificare geni candidati. La mappa genetica me lo permetterebbe perche’ non riguarda specifiche sequenze, ma anche locus di cui non conosco la sequenza. Non posso pero’ studiare il gene candidato perche’ non ho la sequenza corrispondente. • La possibilita’ di utilizzare STS e EST polimorfici ha • permesso di risolvere il problema by N.A.

34. 2 1 mappa fisica:contiguo DNA genomico H F* A* C A+,B-,C+.. Q B* H F Q A C B D G D G* A-,B+,C+.. B+,D+,G+ Clonaggio mappa genetica: A, G e F sono in linkage il loro ordine e’ F-A-G H+,F+,T-.. F+,T-,Q+.. screening library con PCR Sequenziamento GACTTAG........CATAGCA ~300bp H F Q A C B D G I due contigui sono sullo stesso cromosoma e via cosi.... scelta dei primers x A,B,C.. Gli STS: Sequence Target Site L’automazione del sequenziamento permette di sequenziare corte sequenze (300pb) clonate a caso da cui ricavare primers per “screenare” con la PCR ormai automatizzata le librerie e costruire mappe fisiche attraverso la creazione di contigui . Quando sono polimorfiche sono marcatori comuni alle mappe sia genetiche che fisiche e permettono di legarle fra loro STS A,B,C.. by N.A.

35. Studiare un genoma • Studiare un genoma significa : • clonare le sue sequenze, • ordinare i cloni per ricomporre l’organizzazione spaziale delle sequenze • comprendere l’architettura del genoma identificando i diversi tipi di DNA e la loro distribuzione • identificare i geni e la loro funzione • studiarne l’evoluzione attraverso il confronto con altri genomi by N.A.

36. Come identificare i geni Analisi al computer Informazioni cliniche Informazioni di laboratorio A1:Omologo animale mappato? B1:regione cromosomica candidata? C1:raccolta famiglie per mappatura D1:mappatura genetica: ricerca genomica E1:trovata la localizzazione? SI NO SI NO SI NO E2: errore nel tipo di eredita’ o eterogeneita’ genetica C2:delezioni o traslocazioni cromosomiche D2:clonaggio dei punti di rottura A2:Omologo animale clonato? B2:Verifica nei database dei geni della regione D3:nuovi geni umani identificati E3:ripensare ai geni candidati: vai A2,A3,D3 A3:Ricerca nei database genetici B3:Possibile gene candidato? D4:struttura genomica e sequenza completa NO B4:e’ stato completamente caratterizzato? NO E5:trovate mutazioni patogene? C5:Raccolta pazienti non imparentati D5:Ricerca delle mutazioni SI TROVATO!!! SI by N.A.

37. Strategie • CLONAGGIO FUNZIONALE: le basi biochimiche della funzione in studio sono note. Utile in pochi casi • CLONAGGIO POSIZIONALE: si conosce solo la localizzazione cromosomica del locus. Richiede la costruzione di una mappa fisica e genetica della regione. • STRATEGIE CON GENE CANDIDATO INDIPENDENTI DALLA LOCALIZZAZIONE: e’ necessario correlare il fenotipo a modelli animali o porre in relazione il fenotipo a famiglie geniche gia’ note • STRATEGIE CON GENE CANDIDATO CONOSCENDO LA LOCALIZZAZIONE: sono quelle attualmente piu’ utilizzate, soprattutto per la possibilita’ di utilizzare le banche dati. by N.A.

38. Richiamiamo un po’ di terminologia • Genotipo: costituzione genetica di un individuo in relazione ad un particolare carattere • Fenotipo: manifestazione fisica del carattere, non e’ necessariamente una patologiaintesa in senso clinico • La manifestazione fisica dipende dal metodo di rilevazione: es. anemia falciforme, thalassemia, emoglobinopatie E’ l’operatore che sceglie il livello di indagine e definisce il fenotipo che vuole seguire: l’individuo, gli organi, il tessuto, le cellule, il DNA... • Locus: regione genomica dove mappa la sequenza di DNA coinvolta nella manifestazione del fenotipo. E’ individuato utilizzando tecniche laboratoristiche diverse: biochimiche, molecolari, citogenetiche by N.A.

39. Gene e fenotipo • il “gene” mendeliano e’ un entita’ astratta identificata dalla modalita’ di segregazione e dalla mappatura in un LOCUS • il “gene” molecolare e’ una sequenza codificante corrispondente ad un trascritto, che mappa nella regione identificata dal locus • Non esiste necessariamente corrispondenza 1:1 fra fenotipo mendeliano e sequenze codificanti by N.A.

40. Gene e fenotipo • Non esiste necessariamente corrispondenza 1:1 fra fenotipo mendeliano e sequenze codificanti Charcot Marie Tooth 1A ,fenotipo autosomico dominante: la mutazione piu’ frequente e’ una duplicazione di un frammento genomico di 1.5Mb che comprende parecchi geni. Prader-Willi/Angelmann,fenotipi autosomici dominanti: la mutazione piu’ frequente e’ la delezione di un segmento genomico che puo’ arrivare a 4Mb by N.A.

41. Richiamiamo un po’ di terminologia • Autosomico: locus che mappa su un autosoma • Legato al sesso :locus che mappa sui cromosomi sessuali • Alleli:forme alternative del locus che originano fenotipi distinguibili. Nella popolazione possono esistere n alleli, ma ogni individuo diploide ne possiede 2 degli n possibili. Gli alleli si originano per effetto delle mutazioni, e generano variabilita’ nella popolazione. Non e’ detto che ci sia un allele che genera fenotipo patologico. (gruppi sanguigni) • Omozigote:individuo in cui entrambi gli alleli sono uguali • Eterozigote:individuo in cui gli alleli di un locus sono differenti • Ricordare che omozigote ed eterozigote non sono sinonimi di dominante e recessivo by N.A.

42. Definizione classica • Dominante: Carattere che si manifesta in eterozigosi • Recessivo: Carattere che si manifesta in omozigosi • SONO CONCETTI CHE SI RIFERISCONO ALLA MODALITA’ DI TRASMISSIONE E DIPENDONO DAL TIPO DI FENOTIPO CHE SI CONSIDERA: ANEMIA FALCIFORME: Recessivo se considero come fenotipo la presenza dell’anemia: i portatori non hanno anemia Codominante se considero le catene dell’emoglobina : sono presenti entrambe Se guardo la sequenza del DNA non e’ nell’una nell’altra, perche’ non sto guardando l’espressione del prodotto by N.A.

43. Definizione classica • Dominante: Carattere che si manifesta in eterozigosi • Recessivo: Carattere che si manifesta in omozigosi • SONO CONCETTI CHE SI RIFERISCONO ALLA MODALITA’ DI TRASMISSIONE Da questo deriva che la terminologia A/a che correttamente si usa negli incroci quando si vuole indicare la relazione fra i prodotti degli alleli e’ una terminologia operativa: significa che il fenotipo originato da un allele non e’ evidenziabile se c’e’ l’allele A e quindi mi devo aspettare che soggetti con fenotipo A siano geneticamente Aa e questa informazione mi viene dall’analisi degli alberi genealogici o dall’incrocio Inoltre va ricordato che anche utilizzando A/a non vuol dire che a e’ derivato da A e costituisce un sottoprodotto di A. La terminologia che si deve usare al di fuori dello studio della trasmissione e’: locus A alleli A1,A2, A3, An.. (locus white in Drosophila) by N.A.

44. Dominanza e recessivita’ • SONO CONCETTI CHE SI RIFERISCONO ALLA MODALITA’ DI TRASMISSIONE • SONO DOVUTI ALL’INTERAZIONE DEL PRODOTTO DEI SINGOLI LOCUS CON L’AMBIENTE, IL BACKGROUND GENETICO DEL SINGOLO INDIVIDUO E IL PERIODO DELLO SVILUPPO E DIFFERENZIAMENTO • SI APPLICANO PERCIO’ ALLA POPOLAZIONE NON ALL’INDIVIDUO • A LIVELLO DI POPOLAZIONE MEGLIO PARLARE DI LOCUS: IL TERMINE GENE ASSUME SIGNIFICATI DIVERSI A SECONDA DEL TIPO DI INDAGINE • LA GENETICA UMANA E’ FORSE L’ULTIMA DISCIPLINA CHE VIENE APPLICATA AD UNA POPOLAZIONE NATURALE by N.A.

45. Dominanza e recessivita’ • Non si applicano al gene inteso come sequenza di DNA o locus. • In alcune patologie (es.Fibrosi Cistica) gli affetti possono essere definiti eterozigoti composti:questo perche’ esistono mutazioni diverse che provocano la malattia. Di fatto gli affetti non hanno l’allele normale, ma due alleli patologici. Geneticamente sono eterozigoti perche’ hanno due alleli diversi, ma dal punto di vista fenotipico sono indistinguibili dagli omozigoti. Il carattere e’ comunque recessivo • Si puo’ continuare ad usare il termine dominante e recessivo, ma va tenuto ben presente il significato e soprattutto non va confuso con: dominante=+diffuso, recessivo=patologico, dominante=normale etc.... by N.A.

46. Clonaggio funzionale si parte da D3 SI Analisi al computer Informazioni cliniche Informazioni di laboratorio A1:Omologo animale mappato? B1:regione cromosomica candidata? C1:raccolta famiglie per mappatura D1:mappatura genetica: ricerca genomica E1:trovata la localizzazione? SI NO SI NO SI NO E2: errore nel tipo di eredita’ o eterogeneita’ genetica C2:delezioni o traslocazioni cromosomiche D2:clonaggio dei punti di rottura A2:Omologo animale clonato? B2:Verifica nei database dei geni della regione D3:nuovi geni umani identificati E3:ripensare ai geni candidati: vai A2,A3,D3 A3:Ricerca nei database genetici B3:Possibile gene candidato? D4:struttura genomica e sequenza completa NO B4:e’ stato completamente caratterizzato? NO E5:trovate mutazioni patogene? C5:Raccolta pazienti non imparentati D5:Ricerca delle mutazioni SI TROVATO!!! by N.A.

47. Clonaggio funzionale • Creazione di una library di cDNA in vettore di espressione • Produzione di anticorpi specifici • Screening della library di espressione e isolamento della colonia • Ricerca nei topi del DNA corrispondente al cDNA clonato • Sequenza dei cDNA cercando una ORF • Screening di una library di DNA genomico per isolare la sequenza completa • Analisi del DNA degli affetti per individuare le mutazioni Albinismo: Tirosinasi EMOFILIA A: deficienza del fattore VIII FENILCHETONURIA: deficienza fenilalanina-idrossilasi by N.A.

48. Clonaggio funzionale si parte da A1 SI Analisi al computer Informazioni cliniche Informazioni di laboratorio A1:Omologo animale mappato? B1:regione cromosomica candidata? C1:raccolta famiglie per mappatura D1:mappatura genetica: ricerca genomica E1:trovata la localizzazione? SI NO SI NO SI NO E2: errore nel tipo di eredita’ o eterogeneita’ genetica C2:delezioni o traslocazioni cromosomiche D2:clonaggio dei punti di rottura A2:Omologo animale clonato? B2:Verifica nei database dei geni della regione D3:nuovi geni umani identificati E3:ripensare ai geni candidati: vai A2,A3,D3 A3:Ricerca nei database genetici B3:Possibile gene candidato? D4:struttura genomica e sequenza completa NO B4:e’ stato completamente caratterizzato? NO E5:trovate mutazioni patogene? C5:Raccolta pazienti non imparentati D5:Ricerca delle mutazioni SI TROVATO!!! by N.A.

49. Variante: identificazione conoscendo la funzione normale Wild type topo sh2/sh2 topo sh2/sh2 topo sh2/sh2 Wild type topo shaker2 topo sh2/sh2 Complementazione nel topo transgenico:il gene DFNB3 identificato grazie al gene di topo. Il topo shaker2 ha una patologia vestibolare che si riconosce perche’ gira su se stesso e scuote la testa. Si iniettano uova sh2/sh2 con BAC di topo wt. X Mappato per linkage in 1cM del cromosoma11 di topo(17 umano) Si isola il BAC umano con primer esonici e si isola la sequenza umana, cercano le mutazioni nei pazienti BAC### Si sequenzia il BAC murino e si cercano le mutazioni nei topi mutanti si identifica il gene e la sua funzione by N.A.

50. Variante: identificazione conoscendo la funzione normale Trasfezione di frammenti di DNA umano da tumore Coltura di cellule NIH-3T3 di topo Isolamento di oncogeni attivati: cellule di topo vengono trasfettate con DNA derivato da un tumore umano, se crescono in maniera incontrollata vuol dire che contengono un oncogene Selezione di una colonia trasformata ricerca sequenze Alu Alcune cellule sono trasformate fagi che potrebbero contenere l’oncogene by N.A.