Proteiinianalyysi 52930 (2 ov)

1. Proteiinianalyysi 52930 (2 ov) Liisa Holm

2. Organisaatio • Luennot & Laskuharjoitukset • 30.3.-28.4.2005, ke, to 14-16, LS 2012 • http://www.bioinfo.biocenter.helsinki.fi:8080/downloads/teaching/spring2005/proteiinianalyysi/index.html • Tentti • Bonusta aktiivisuudesta laskuharjoituksissa • Oheislukemisto • Lesk: Introduction to bioinformatics. Oxford University Press.

3. Aikataulu

4. Kurssin tavoitteet • miten proteiinisekvenssejä luetaan • proteiinien luokittelujärjestelmät • sekvenssi – rakenne – funktio • evoluutio

5. Muut kurssit • Esitiedot: • Geneettinen bioinformatiikka 1-2 ov • sekvenssivertailu • fylogeniapuut • Soveltaminen: • Proteiinianalyysin harjoitustyöt 3 ov • webbityökalujen käyttö

6. Johdanto

7. Proteiinien merkitys • Proteiinit tekevät kaiken työn solussa ja ovat osallisina: • Geenisäätelyssä • Metaboliassa • Signaloinnissa • Tukirangassa • Kuljetuksessa • Solunjakautumisessa http://www.websters-online-dictionary.org/definition/english/ce/cell.html

8. Structural proteins • Collagen 1K6F http://www.aw-bc.com/mathews/ch06/fi6p13ad.htm

9. Actin and muscles

10. Enzymes • Catalytic triad: Asp, Ser, His 1CHO

11. Transcription factors Ligand DNA 1L3L

13. Mistä proteiinit tulevat? • DNA > RNA > proteiini • geneettinen koodi • DNAn emäskolmikko koodaa yhtä aminohappoa • 20 aminohappoa • lineaarinen sekvenssi • tyypillinen pituus 100-400 aminohappoa • keskimäärin noin 150 aminohappoa

14. Suuri yllätys … DNA:n rakenne on hyvin säännölinen Watson & Crick (1953)

15. Myoglobiini Proteiinin rakenteesta puuttuu symmetria Kendrew & Perutz (1957) 1mbn

16. aina = biologinen aina (poikkeuksia löytyy) Proteiinit ovat erikoislaatuisia polymeerejä: • Tietyllä proteiinilla on aina sama aminohapposekvenssi • Proteiinin sekvenssi määräytyy DNA-sekvenssin perusteella • Tietyllä proteiinilla on aina uniikki kolmiulotteinen rakenne. • Proteiinin rakenne määräytyy aminohapposekvenssin perusteella.

17. Ei funktiota ilman rakennetta • Luonnon proteiinit laskostuvat spesifiseksi kolmiulotteiseksi rakenteeksi • komplementaarinen interaktiopartnerille • Denaturaatio tuhoaa funktion

18. EvoluutioSekvenssi – Rakenne - Funktio Luonnonvalinta DNA-sekvenssi Proteiinin funktio Proteiinin sekvenssi Proteiinin rakenne

19. Sekvenssi

20. proteiinien identifiointi • klassinen biokemia • proteiinin puhdistus • molekyylipaino • isoelektrinen piste • CD- ym. spektroskopia • jne. • laskennallinen analyysi • DNA-sekvenssi  geenintunnistus, eksonit/intronit  käännös proteiiniksi • sekvenssivertailut • post-genomiikka • transkriptioprofilointi, proteiini-proteiini-interaktiot, ym.

21. Historiaa

22. Genomit • DNA-sekvensointi • entsymaattinen synteesi, spesifiset terminaattorit • proteiinisekvenssit johdetaan DNA-sekvenssistä • ORF, open reading frame • varmennus: linjaus tunnetun EST:n tai cDNA:n tai proteiinin kanssa • eukaryoottien eksoni-introni-ongelma • genomiprojektit • noin 136 organismia • eukaryootteja, arkebakteereja ja eubakteereja

24. Proteome coverage About 136 complete proteomes deduced from complete genomes.

25. Täydellinen proteomi • varmuus ”puuttuvista” geeneistä • kaikki geenit eivät ekspressoidu samaan aikaan ja samassa paikassa • vaihtoehtoinen silmukointi, post-translationaaliset modifikaatiot: yhdestä geenistä voikin tulla monta proteiinia • glykosylaatio • fosforylaatio

26. Tietokantoja • EBI • http://www.ebi.ac.uk • http://www.ebi.ac.uk/proteome • NCBI - Entrez • http://www.ncbi.nlm.nih.gov • nrdb, ’non-redundant database’ • 490.374.618 aminohappoa • 1.504.726 sekvenssiä

27. Rakenne

28. Protein structure • Primary structure • Secondary structure • Super-secondary structure • Tertiary structure • Quaternary structure

29. Secondary structure • backbone • no amino acid side chains • regular patterns • of hydrogen-bonds • backbone torsion angles • types of secondary structure • α-helix • β-sheet • ...

30. α-Helix hydrogen bond pattern: n, n+4 β-Sheet

31. β-sheet β-strands view from the side view from the top http://broccoli.mfn.ki.se/pps_course_96

32. Cartoon representation 2AAC 2TRX

33. Supersecondary structures • local arrangments of secondary structure elements http://www.expasy.org/swissmod/course/text/chapter2.htm

34. Tertiary structure 1coh

35. Quaternary structure 1coh

36. Protein structure determination • Protein expression • membrane proteins • aggregation • X-Ray crystallography • NMR (nuclear magnetic resonance) • Cryo-EM (electron microscopy)

37. Structures by X-ray crystallography • Crystallize protein • Collect diffraction patterns • Improve iteratively: • Calculate electron density map • Phase problem • Fit amino acid trace through map

38. X-ray crystallography • Crystallization • “An art as much as a science” Charges http://crystal.uah.edu/~carter/protein/crystal.htm

39. Diffraction and electron density maps Intensities X-ray source Crystal Diffraction pattern

40. Iterative refinement Resolution Higher resolution = more accurate positioning of atoms http://www.sci.sdsu.edu/TFrey/Bio750/Bio750X-Ray.html

41. NMR • Create highly concentrated protein solution • Record spectra • Assign peaks to residues • Calculate constraints • Compute structure

42. NMR spectra 2D 1D http://www.cryst.bbk.ac.uk/PPS2/projects/schirra/html/2dnmr.htm

43. H R Hα CO CO Torsion angle Distance constraints from NMR • From the sequence • Topology • Bond angles • Bond lengths • From the NMR experiment • Torsion angles • Distance constraints

44. Ensemble of structures SH3-domain 1aey

45. What is the true protein structure? • X-Ray • “frozen” state of a protein • crystal contacts • large protein structure • NMR • protein in solution • limited in size

46. Molecular complexesvia X-ray 30 S subunit of the ribosome Protein RNA 1fjg

47. Cryo-EMSingle particle image reconstruction Bacteriophage MS2 Koning et al. (2003)

48. Fitting X-Ray structures into density maps

49. GroEL-complex Hemoglobin 1gr6

50. Protein structure databases http://www.wwpdb.org/index.html