Complementarità geometrica e fisica tra un E ed un substrato dipendente da forze non covalenti

3. ENZIMICatalizzatori prodotti da cellule viventi ma capaci di agire indipendentemente da esseDeterminano tutti i processi di degradazione, sintesi, trasformazione e conservazione dell’energia nella formazione ed evoluzione della materia vivente.Sono PROTEINEspesso associate ad un metallo o molecola organica

4. CATALISI⇓legata ai gruppi R degli amminoacidi la cui natura e disposizione residua individua una tasca detta SITO ATTIVO. E’ fondamentale la conformazione nativa della proteina per la sua funzione catalitica.DENATURAZIONE ⇒ MODIFICA STRUTTURA NATIVA ⇒ DISATTIVAZIONE DELL’ENZIMA

5. Complementarità geometrica e fisica tra un E ed un substrato dipendente da forze non covalenti

6. CATALISI OMOGENEA sub. e cat. nella stessa fase CATALISI ETEROGENEA sub. e cat. in fasi diverse Incremento di velocità 108-1020 volte con eventuale fondamentale intervento di componenti non proteiche (ioni Me o coenzimi). Struttura tridimenzionale dell’E fondamentale per la conoscenza dello stato di transizione e quindi del meccanismo di reazione. SITO ATTIVO = PARTE DELL’ENZIMA IN CONTATTO CON IL SUBSTRATO (zona piccola in confronto alle dimensioni dell’enzima). Modificazioni sito attivo scomparsa attività enzimatica.

7. Struttura primaria e strutture superiori determinate dalla sintesi proteica = predestinazione di una proteina a funzionare da enzima.  PM enzimi = da 12000 a 106 Molecola su cui opera l’enzima = substrato DIMENSIONE ENZIMA » DIMENSIONE SUBSTRATO

8.  Apoenzima(denaturato con cal.) • + • cofattore o gruppo prostetico (stabile al riscaldamento) • ⇓ • Enzima completo (oleoenzima) • Enzimi richiedono cofattori per funzionare che possono essere ioni inorganici (Fe, Mg, Mn, Zn, Mo etc.) o molecole organiche (coenzimi) che possono essere: •   legati debolmente alla proteina •   legati saldamente alla proteina (gruppo prostetico)

9. ATP ⇒ metabolita coezimatico + comune (cosubstrato modificato nella reazione e dissociato) NAD+ e NADP+⇒ coenzimi nucleotidici piridinici associati a deidrogenasi che catalizzano il trasferimento di un H- da un substrato al nucleotide portandolo nella forma ridotta con rilascio di H+ Coenzima A⇒coenzima derivato dall’acido pantotenico è coinvolto nel trasferimento di gruppi acilici CH3CO- Altri coenzimi sono: Biotina, Acido Lipoico, vitamine A, D, E e K.

11. Enzimi identificati da 4 numeri:1.   Appartenenti a una delle classi relative alla reazione catalizzata2.   Appartenenza ad una sottoclasse3.   Appartenenza ad una sottosottoclasse4. Posizione progressiva nella sottosottoclasse

12. EsempioATP + glucosio = ADP + glucosio-6-fosfatoCatalizzatore esochinasi (nome comune) o ATP-glucofosfotransferasi (catalizza il trasferimento del P da ATP a glucosio). Numero dell’enzima 2.7.1.1.2. classe delle transferasi7. sottoclasse fosfotransferasi1.   sottosottoclasse fosfotransferasi con OH come gruppo accettore1.glucosio come accettore del gruppo fosforico.

13. Enzima Chirale riesce a distinguere tra gruppi della molecola stericamente non equivalenti. • Risulta perciò altamente specifico e distingue due diversi stereoisomeri o nella reazione con un centro Pro-chirale genera uno solo dei possibili isomeri (geometrici o ottici) • SPECIFICITA’ DEGLI EMZIMI • Un enzima può avere diversi gradi di specificità: • Specificità che tiene conto del legame (specificità di legame, Bassa specificità) • Specificità che tiene conto di una parte della molecola (specificità di gruppo) • Specificità che richiede le due parti della molecola ed il legame che le unisce (specificità assoluta).

14. Es. • A-B + H2O = AOH + BH • la natura di A e B non è importante • A o B devono essere determinate • A e B devono essere del tipo appropriato. • Maltasi: catalizza l’idrolisi del maltosio ma essa può operare sugli a-glucosidi cioè sul glucosio legato con legame a-glucosidico ad un altro zucchero qualsiasi (specificità di gruppo).

15. Meccanismo reazione enzimatica • Catalisi per abbassamento Ea per stabilizzazione chimica del complesso attivato e/o + corretto orientamento geometrico per la formazione del complesso attivato • E con S forma ES ad energia + bassa in un equilibrio non alterato, riuscendo a discriminare tra parecchi substrati (specificità) in competizione per il S.A. nel quale ci sono gruppi funzionali che: • Reagiscono temporaneamente con S • Predispongono S a formare P

16. I gruppi catalitici di E interagendo con S lo preparano (attivano) alla reazione abbassando Ea. • Tra substrato-enzima si forma il complesso ES la cui energia di legame serve per: • Compensare la riduzione dell’entropia (avvicinamento e orientamento substrato) • desolvatare il substrato • indurre binding produttivo o adattamento indotto Dall’energia del legame E-S dipendono la catalisi e la specificità.

17. DIVERSI TIPI DI CATALISI Catalisi acido base specifica se dovuta a H+ o OH- o generale se dovuta a gruppi accettori o donatori di protoni (sulle catene laterali degli a.a. e più comune al pH 7 della cellula) Catalisi covalente mediante formazione di un complesso attivato stabile per la formazione di legami covalenti tra E ed S.

19. Meccanismo catalisi enzimatica

22. Andamento cinetico

23. Il sito attivo

24. Cinetica Enzimatica La velocità iniziale di una reazione aumenta quasi linearmente all'aumentare della concentrazione di substrato. Vo La velocità è direttamente proporzionale alla concentrazione del substrato e la reazione è di primo ordine V = k [S] [S]

25. Vmax Cinetica Enzimatica La proporzionalità fra V e [S] progressivamente diminuisce. V La velocità iniziale diventa indipendente dalla [substrato] e la reazione è di ordine zero rispetto al substrato. [S]

26. affinità La costante di Michaelis (KM) kM kM kM kM kM kM kM

27. Effetti della concentrazione dell’enzima Vmax è direttamente proporzionale alla [E] Km è indipendente dalla [E] e dalla [S]

28. Unità Internazionale la quantità di enzima che catalizza la formazione di una micromole di prodotto in un minuto kcat o numero di turnover il numero di molecole di substrato convertite in prodotto nell'unità di tempo da una molecola di enzima quando è saturata con il substrato.

29. k1 k2 E + S ESE + P k-1 efficienzacatalitica kcat= k2 Vmax = kcat [ET] kcat kcat kcat kcat kcat kcat

33. Chimotripsina Pepsina Tripsina Velocità di reazione Velocità di reazione pH Temperatura, °C Che cosa influenza la velocità della reazione? TEMPERATURA pH • Andamento variabile con uno o più massimi di attività a diversi pH. A pH estremi: • si può alterare irreversibilmente la stabilità dell’enzima • si può modificare la ionizzazione di S influenzando il legame ES • si può modificare la ionizzazione dell’E modificandone l’affinità per S • si può modificare la ionizzazione la ionizzazione del complesso ES • Gli effetti 2 e 3 influenzano la KM il 4 la Vmax. La velocità aumenta all’aumentare di T, ma nella catalisi enzimatica un aumento di T può portare ad una variazione di conformazione con perdita conseguente dell’attività catalitica. Di solito si ha un max di attività tra 40°C e 60°C e la denaturazione completa a 90-95 °C.

34. Influenza della temperatura Lo studio attività/temperatura permette di calcolare dall’equazione di Arrenius K=A e-Ea/RT dalla cui linearizzazione si possono calcolare: Ea (molto + basso nelle reazioni enzimaticamente catalizzate) Q10= coefficiente termico ovvero fattore di cui aumenta la velocità quando T aumenta di 10°C. Reazioni non catalizzate Q10= 2 Reazioni catalizzate 1<Q10< 2

35. Influenza del pH • Andamento variabile con uno o più massimi di attività a diversi pH. A pH estremi: • si può alterare irreversibilmente la stabilità dell’enzima • si può modificare la ionizzazione di S influenzando il legame ES • si può modificare la ionizzazione dell’E modificandone l’affinità per S • si può modificare la ionizzazione la ionizzazione del complesso ES • Gli effetti 2 e 3 influenzano la KM il 4 la Vmax.

36. REAZIONI CON PIU’ SUBSTRATI Reazioni sequenziali = reazioni con + substrati tutti presenti affinchè si abbia la liberazione di prodotti

37. Reazioni a ping-pong = prodotto liberato prima che tutti i substrati siano stati legati. S1 per primo si lega ad E che subisce una modificazione per sostituzione liberando il primo prodotto: poi l’enzima modificato si lega al secondo substrato S2 formando il secondo prodotto e liberando l’E nella forma originaria.

38. SISTEMI MULTIENZIMATICI • Reagiscono in una serie consecutiva di reazioni in cui P diventa S della reazione successiva (azione concertata da 2 a 20 E di reazioni in sequenza). • Sistemi multienzimatici in fase solubile (glicolisi) • Sistemi multienzimatici fisicamente associati con ridotti problemi di diffusione (ac. grasso sintetasi) • Sistemi associati a membrane o ribosomi (complessi della catena respiratoria)

39. Inibitori enzimatici Irreversibili Reversibili

40. INIBIZIONE ENZIMATICA • Inibitori (I) =diminuiscono le velocità di reazione • L’inibitore può legarsi all’enzima mediante legami: • Fisici (inibizione reversibile) con l’allontanamento di I si ripristina l’attività di E • Chimici (inibizione irreversibile) la formazione di legami covalenti impedisce il semplice allontanamento dell’I.

41. INIBIZIONE REVERSIBILE Inibizione competitiva = I compete con S per il sito attivo di E Si può ridurre aumentando la [S]. Cambia KM non cambia Vmax Inibizione non competitiva = I si lega ad E in un sito diverso dal sito attivo. Si abbassa la Vmax ma non si modifica la KM Inibizione incompetitiva = I si lega solo al complesso ES. E + S  ES  E+P; ES+I  ESI Si modificano entrambe le costanti cinetiche.

42. Inibizione Competitiva Inibizione competitiva per formazione di legami col sito attivo mutuamente escludenti

43. Un inibitore competitivo ridurrà l'affinità enzima substrato, cioè aumenterà il valore di Km. Ad alte concentrazioni di substrato la reazione non viene rallentata e Vmax è sempre la stessa.

44. Inibizione non-competitiva Inibizione competitiva per cambiamento di conformazione mutuamente escludenti

45. Inibizione incompetitiva Il substrato non viene più convertito in prodotto

46. I La KM rimane invariata La Vmax diminuisce

50. Gli inibitori irreversibili si combinano o distruggono un gruppo funzionale dell’enzima essenziale per l’attività catalitica. Es. Inibitori suicidi o inattivatori basati sul meccanismo che portano avanti le prime tappe della reazione enzimatica normalmente, poi invece di essere convertiti nel prodotto di reazione diventando composti molto reattivi che si legano irreversibilmente all’enzima. Inibizione da prodotto = prodotto che compete con il S al sito attivo formando EP.