PCR en temps réel (PCR quantitative)

1. PCR en temps réel (PCR quantitative)

2. But • Comprendre la difference fundamentale entre la PCR en temps réel and la PCR traditionnelle • Comprendre les calculs de base pour la quantification avec la PCR en temps réel • Comprendre les differences entre la PCR en temps réel et le transfert Northern

3. Applications de la PCR en temps réel • Méthode quantitative puissante • Expression génique • Détermination/suivi de la charge virale • Quantification de gènescancerigène • Vérification de biopuce • Vérification de transgène • Analyses de SNP

4. Étapes de la PCR en temps réel • Trois phases Plateau Quantité de produit de PCR Phase linéaire Phase exponentielle Nombre de cycles

5. Amplification exponentielle Xn= X0 * (1 + E) n E = [10(–1/pente)] – 1 (Efficacité = 1dans la phase exponentielle) Xn = Copies d’ADN au cycle n X0 = Copies d’ADN au cycle 0 E = Efficacitéd’amplification n = Nombre de cycles

6. Système de détectionquantitatif • Détection de la fluorescence • Deux types de fluorochromes • Ceux qui se lient à l’ADN double brin • Sondes à ADN avec fluorochrome

7. SYBR green (Lie l’ADN double brin) SYBR green Plus commun

8. Sondes avec fluorochromes (FAM, VIC, TET, FRET) Moinscommun Fluorochrome Atténuateur

9. Vs. Sondes avec fluoro. SYBR green • Ne discrimine entre le gèned’interêt et d’autres ADN (e.g. contamination) • Ne permet pas la PCR multiplex • Moinsd’étapesrequises • Moinscoûteux • Discrimine, plus spécifique • Permet la PCR multiplex avec usage of different fluoro. • Requiertmoinsd’étapes • Pluxcoûteux

10. Zones de détectionPCR en temps réelvs PCR trad. PCR traditionnelle EtBr Quantité de produit de PCR Nombre de cycles PCR en temps réel

11. Quantification de l’amplicon de PCR en temps réel • Augmentation de la fluorescence estproportionnelleàl’amplificationd’ADN • Le premier cycle auquell’instrumentpeutdéterminerl’augmentation de fluorescence commeétant au dessus du bruit de fond est le cycle seuil“Ct” (threshold cycle)

12. Le cycle seuil(Ct) Exemple de Ct Ct

13. Le cycle seuil(Ct) Ct de troisdifférentséchantillons

14. Le cycle seuil(Ct) • Le Ct estinversementproportionnelà la concentration initiale d’un échantillon • e.g. Plus la concentration d’ADNestgrande plus la valeur du Ct est petite

15. Méthodesquantitatives • Quantification absolue • Pour déterminer la quantitéexacted’ADN (e.g. charge virale) • Quantification relative • Pour déterminer le changementd’expressiongénique

16. Quantification absolue • Si la quantitéinitialed’DNAestconnue: XT = X0 * (1 + E) Ct • Si non, les Ct des échantillonsdoiventêtrecomparés à ceuxd’unecourbed’étalon XT = quantitéd’ADN au cycle seuil X0 = quantitéd’ADN au cycle 0 E = efficacitéd’amplification Ct = cycle seuil

17. Quantification absolue Echantillondu gèneMel1dont le Ct après amplification est22.5 cycles. Quelleest la concentration de l’amplicon?

18. Quantification absolue Concentration de l’amplicon de Mel1 Ct de 22.5 y = -3.1392 x + 18.221 22.5 = -3.1392 x + 18.221 x = -1.3630 10 -1.3630 (Log inverse de 10) La concentration d’ADNest0.043 µg/ml

19. Quantification relative • Normaliser le gèned’interêt à un gènedomestique Échantillon Gènedomestique Rapport

20. Vs. Transfert northern PCR en temps réel • Plus sensible (besoin ~50 ngd’ADN) • Plus précis (peutdéterminer no copies) • Matriced’ADN (stable) • Ne donne pas la taille des transcrits • Plus rapide (justequelquesheures) • Moinsd’étapesimpliquées • Moins sensible (besoin de ~10 ugd’ADN) • Moins précis (ne peut pas déterminer no copies) • Matriced’ARN (instable) • Donne la taille des transcrits • Long (Plusieursheures à jours) • Beaucoup d’étapesimpliquées