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Massenspektrometrie – eine Einführung

Massenspektrometrie – eine Einführung. H. Luftmann Abt. Massenspektrometrie. Wozu dient die Massenspektrometrie?. Mir ihrer Hilfe kann man die Masse von Atomen und Molekülen bestimmen. In einem Bereich von 1Da..>100kDa. Mit einer Massengenauigkeit von bis zu 1ppm.

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Massenspektrometrie – eine Einführung

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  1. Massenspektrometrie – eine Einführung H. Luftmann Abt. Massenspektrometrie

  2. Wozu dient die Massenspektrometrie? Mir ihrer Hilfe kann man die Masse von Atomen und Molekülen bestimmen. In einem Bereich von 1Da..>100kDa Mit einer Massengenauigkeit von bis zu 1ppm Von Probenmengen im Bereich < 10-6 .. 10-15g Über Fragmentierungen erhält man Strukturhinweise Mir ihrer Hilfe kann man die Menge von Verbindungen bestimmen. Durch die Massenselektivität gelingt das auch in Gegenwart vonBeimengungen (mit anderer Masse). Von Mengen im Bereich < 10-6 .. 10-15g

  3. Substanzeinlass Ionenquelle Analysator Detektor Was sind die Voraussetzungen für eine MS-Messung? • Die Moleküle müssen vereinzelt, d.h. von ihresgleichen und von allen anderen abgetrennt werden. Wechselwirkungen würden die Massenbestimmung stören. • Die Moleküle müssen ionisiert werden. Die Ladung dient als „Griff“ um Kräfte auf das Molekül auszuüben.

  4. MS GC Substanzeinlass Ionenquelle Analysator Detektor Verdampfen der Probe ins Hochvakuum – Direkteinlass, Tiegeleinlass,direct inlet, „Schubstange“ Kopplung eines Gaschromatographen mit einem Massenspektrometer – GC-MS

  5. Radikalkationen +• Ins Vakuum einschleusen Verdampfen Ionisieren + Vom neutralen Molekül zum Ion im Hochvakuum EI

  6. 0V positive Spannung fürpositive Ionen Substanzeinlass Ionenquelle Analysator Detektor Elektronenionisation* - EI 10-5..10-7mBar Turbomolekularpumpe * Die veraltete Bezeichnung ist Elektronenstossionisation

  7. Substanzeinlass Ionenquelle Analysator Detektor Elektronenionisation* - EI • Bei der (EI) wird die Substanz im Hochvakuum mit 70eV Elektronen beschossen. Der größte Teil der Energie wird nicht auf das Molekül übertragen. Lediglich 6-10eV dienen zur Ionisation nach dem Schema: • M + e- M+. + 2e- • Darüber hinaus werden noch 2-10eV Energie (sog. Überschußenergie) auf das Molekül übertragen. Das führt zur Anregung des Moleküls und zur Fragmentierung. Ein EI-Spektrum ist die Auftragung derHäufigkeit der im Zeitraum von 10-8 sgebildeten Ionen gegen ihren m/z Wert(bei z=1 entspricht das der Masse).

  8. Detektor Ionenbahnen Substanzeinlass Ionenquelle Analysator Detektor Quadrupolanalysator (Quadrupolmassenfilter) Quadrupolstäbe Wechselspannung m/z zu klein Ioneneintritt m/z passend m/z zu gross

  9. Substanzeinlass Ionenquelle Analysator Detektor Sekundärelektronenvervielfacher SEV, secondary electron multiplier SEM Elektronen Ionen V 100V Hoher Verstärkungsfaktor >106geringes Eigenrauschen, schnell.

  10. Die Peakhöhe wird auf den intensivsten Peak (100%) normiert. Die Peaks haben eine Breite, die von der instrumentellen Massenauflösung abhängt. Die x-Achse ist eine m/z Skala! Oft werden die Rohdaten in ein Strichspektrumumgerechnet. Hier kann es zu Rundungs-problemen kommen Das erste Ergebnis jeder Messung ist ein „Rohspektrum“ Die angezeigten Massenwerte stellen die Schwerpunkte oder die Maximalwerte der Rohdatenpeaks dar.

  11. Isotopie und Atomgewichte alle Angaben in Dalton (Da) 12C 98,9% 35Cl 75,7% 79Br 50,7% 81Br 49,3% 1H 99.998% 37Cl 24,3% 13C 1,1% 2H 0.015% Kohlenstoff Chlor Brom Wasserstoff Das stöchiometrische Atomgewicht (average mass) ist das gewichtete Mittel der Isotopeneinzelgewichte 12,011 35,46 79,9 1,0079 Auch die Massen der reinen Isotope sind nicht ganzzahlig (Ausnahme 12C) 12,0000034,968378,917791,007813,00281 2,0141 36,96535 80,91574

  12. 72 76 155 157 192 190 194 73 77 158 C6 C6H4 C6H4Br C6H4BrCl Molekülionen sind meist eine Gruppe von Peaks, sie entsteht durch die Kombination der natürlichen Isotopen der beteiligten Elemente. Schrittweiser Aufbau des Isotopenclusters von C6H4BrCl

  13. Molekulargewichtsdefinitionen (nach IUPAC) Das stöchiometrisches Molekulargewicht (average mass) ist die Summe der Atomgewichte. Darin sind die mit ihrer Häufigkeit gewichteten Isotope in ihrer natürlichen Verteilung enthalten. Das nominale Molekulargewicht ist die Summe der gerundeten Isotopenmassen (der häufigsten Isotope). Das „monoisotopische Ion“ ist die Kombination der häufigsten Isotope. Es ist nicht notwendigerweiseder intensivste Peak eines Isotopenclusters. Eine Massenangabe wird als „exakte Masse“ bezeichnet, wenn sie mit einer Präzision von +-5ppm(oder +-5mDa) bestimmt oder berechnet wurde. Beispiel C6H4BrCl average 191.459 nominal 190 nominal 192 exakte Massen 191.91499 12C61H437Cl79Br 191.9159012C61H435Cl81Br monoistopisch 189.9179 bei nicht ausreichender Auflösung wird der Summenpeak mit m/z 191.9156 gefunden

  14. Unregistered 100 90 80 70 C19H36O C20H40 60 m/z 280.31300281.31645282.31993 m/z280.27661281.28003282.28319 50 40 Unregistered 100 30 90 20 80 10 70 0 280 281 282 283 284 60 50 40 30 20 10 0 280 281 282 283 284 Hochauflösung Befinden sich auf der gleichen Nominalmasse zwei oder mehr Ionen verschiedenerElementarzusammensetzung, so muß die Auflösung des Massenspektrometers besonderserhöht werden, um diese unabhängig voneinander bestimmen zu können. Bei Werten von R10%Tal > 10.000 spricht man von Hochauflösung. Massenunterschied 0,037Da notwendige Auflösung 280/0,037= 7500

  15. .CH3 CO C2H4 HCl EI-Spektrum - Interpretationsansatz CH3CO+ C3H7+ Skyline wohldefinierte Bruchstellen Molekülion m/z 154/155/156/157 Isotopenmuster enthält 1 Chloratom Fragmentierungen M-15, M-15-28, M-15-28-36 charakteristische Ionen m/z 38/39; 50..52; 62..65; 74..78 Alle EI-Beispielspektren sind der NIST Datensammlung entnommen

  16. Bildung stabiler Kationen Abspaltung günstiger (=stabiler) Radikale Abspaltung stabiler (kleiner) Neutralteilchen Was bestimmt den Zerfall von angeregten Radikalkationen?

  17. Beispiel 1 m/z 101 α-Spaltung m/z 86 m/z 58 m/z 30

  18. Stickstoffsregel Ist das Molekülion geradzahlig, so enthält das Molekül eine gerade Anzahl von N-Atomen (oder keine). Ist das Molekülion ungeradzahlig enthält es eine ungerade Zahl von N-Atomen Doppelbindungsregel nC, nH, nN = Anzahl der Atome Die Zahl der Doppelbindungen und/oder Ringe lässt sich folgendermassen berechnen: Wenn Stickstoff anwesend ist, muss das berücksichtigt werden:

  19. Beispiel 2 m/z 142 m/z 71 m/z 57 Keine Abspaltungen von CH2 sondern vonEthen, Propen, Buten usw. m/z 29

  20. Beispiel 3 m/z 134 m/z 91 McLafferty Umlagerung m/z 92

  21. Beispiel 4 McLafferty Umlagerung: das ML-Ion beinhaltet die Alkoholseite und die Position 2 des Esters. Substitution an diesen Positionen verschiebt das Produktion. m/z 74

  22. Beispiel 5 Diese Verbindung enthält nur 1 Heteroatom.

  23. Massenspektrometrie – eine Einführung 139 100 50 111 182 31 43 77 50 69 85 125 147 165 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 Beispiel 6 EI-Spektrum m/z Molekulargewicht m/z 182 Skyline wenige Fragmente, stabiles Ion bei m/z 139 Auffällige Isotopenmuster bei m/z 111, 139, 182  ein Chlor enthalten.

  24. Massenspektrometrie – eine Einführung 139 100 50 111 182 31 43 77 50 69 85 125 147 165 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 Beispiel 6 DBE = ((2*Zahl der C-Atome + 2)-Zahl der H-Atome)/2 Cl zählt als einbindiges Atom wie ein H. EI-Spektrum m/z Molekulargewicht m/z 182 Skyline wenige Fragmente, stabiles Ion bei m/z 139 Auffällige Isotopenmuster bei m/z 111, 139, 182  ein Chlor enthalten. Summenformel C8H19ClO2 C9 H7 Cl O2 C10H11ClO C11H15Cl „übersättigt“ maximal wäre H17 6 Doppelbindungsäquivalente 5 Doppelbindungsäquivalente 4 Doppelbindungsäquivalente

  25. Massenspektrometrie – eine Einführung 139 100 50 111 182 31 43 77 50 69 85 125 147 165 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 Beispiel 6 EI-Spektrum m/z Molekulargewicht m/z 182 Skyline wenige Fragmente, stabiles Ion bei m/z 139 Auffällige Isotopenmuster bei m/z 111, 139, 182  ein Chlor enthalten. Summenformel C9 H7 Cl O2 6 DBE - C10H11ClO - 5 DBE - C11H15Cl 4 DBE Schlüsselion m/z 77 Phenylring CO oder C2H4 mögliche Partialstruktur C3H7 oder C2H3O

  26. Massenspektrometrie – eine Einführung 139 100 50 111 182 31 43 77 50 69 85 125 147 165 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 Beispiel 6 EI-Spektrum m/z bei diesen Strukturen erwartet man einen [M-CH3]+ Peak bei m/z 167 einige Strukturmöglichkeiten (Substitutionsmuster am Aromaten unberücksichtigt)

  27. Radikalkationen +• Ins Vakuum einschleusen Verdampfen Ionisieren + Laserbeschuss Matrixpräparation Kationen + Ins Vakuum einschleusen + + Vom neutralen Molekül zum Ion im Hochvakuum EI MALDI

  28. + Target mit 16x24 = 384 Probenpositionen LDI und MALDI Man kann Verbindungen durch einen intensiven Laserpuls verdampfen und ionisieren. Diese Laser-Desorption-Ionisation mit einem N2Laser erfordert eine Bestrahlungsstärke von ca. 5MW/cm2 . Empfindliche, polare und grosse Moleküle werden bestenfalls als Fragmente detektiert. Um Fragmentierungen zu verhindern, wird die Probe mit einem grossen Überschuss einer Matrixsubstanz gemischt und auf der Probenfläche cokristallisiert. Dieses Gemisch liefert bereits bei 0.5 MW/cm2Bestrahlungsstärke intakte Ionen. Es wird als Matrix-Assistierte Laser-Desorption-Ionisation bezeichenet Die universellste Matrix ist 2,5-Dihydroxybenzoesäure, sie wurde von F. Hillenkamp und M. Karas eingeführt.

  29. + MALDI • Bei der MALDI werden im Gegensatz zur Elektronenstoßionisation keineRadikalkationen erzeugt, sondern es entstehen meist* Ionen mit gerader Elektronenzahl. positiv negativ • Weil der gefundene m/z Wert nicht gleich dem Molekulargewicht ist, sprichtman von Pseudomolekularionen. • Die Überschußenergie ist wesentlich geringer, s.d. man überwiegend intakte Pseudomolekularionen beobachtet. • Die Ionisation ist hervorragend für große Moleküle geeignet (Peptide, ProteineDNA, RNA Fragmente, Oligomere) *Bei Matrices mit Elektronenübertragung (z.B. DCTB) enstehen Radikalkationen oder/und Radikalanionen.

  30. + MALDI Spektrum einer basischen Verbindung C30H43NO2 MW 449.3 Als Matrix wurde 2,5-Dihyroxybenzoesäure verwendet. Unter günstigen Umständen (wie diesen)sieht man nur den Pseudomolekularpeak der Probe.

  31. Intensität Intensität t t Flugzeitmassenspektrometer – „time of flight“ TOF Idealer Analysator bei pulsweiser Ionenproduktion wie sie bei MALDI und LDI vorliegt Laserimpuls Flugrohr (Länge l) Detektor Gitter auf 0V Probe aufHochspannung (U) ca. 20kV e U = ½ m v2 sqrt(2eU/m) = v = s/t e = ElementarladungU = Beschleunigungsspannung m = Masse eines Molekülss = Länge des Flugrohrs t = Flugzeit

  32. + MALDI Spektrum eines Oligomeres – Ionenbildung durch Na+ Anlagerungen Abstand 44 Da Matrixionen Masse der repetierenden Einheit 44Da Vorschlag 481.2 - 10* 44.03 - 23 = 18 Masse der Endgruppen = 18Da Polyethylenglycol

  33. Radikalkationen +• Ins Vakuum einschleusen Verdampfen Ionisieren + Laserbeschuss Matrixpräparation Kationen + Ins Vakuum einschleusen + + Kationen Probe gelöst, Ionenbildung! Versprühen im E-Feld + Transfer zum Vakuum + + + + + Vom neutralen Molekül zum Ion im Hochvakuum EI MALDI ESI

  34. [M+H]+ [M+2H]2+ [M+NH4]+ [M+2Na]2+ [M+Na]+ [M+K]+ [2M+H]+ [2M+NH4]+ Negativmodus [M-H]- Bildung von Dimeren etc wie im Positivmodus [M+Cl]- [M+HCOO]- Welche Pseudomolekularionen können bei ESI beobachtet werden? Positivmodus Bei Gemischen auch Heterodimere Bei sehr leicht oxidablen Verbindungen[M-e]+ [M+H+Na]2+ usw.

  35. 1cm Sehr feine Spitze Kontaktierung (0.6-2kV) Kapillare mit 10ul Probenlösung ES(I) Nanosprayeinlass Geöffnete Sprühkammer Ioneneintritt zum MS N2 Strom zur Desolvatation ESI aus einer Stahl-kapillare (Schleifeneinlass,HPLC)

  36. HPLC-MS Kopplung HPLC-Pumpe Injektionsventil ESI-MS Autosampler Trennsäule

  37. + + ES(I) – Electrosprayionisation (M+H)+ 2-Amino-3-methylbutanol K+ Auch bei sehr empfindlichen Verbindungen keine Fragmentierung zum Vergleich das EI-Spektrum kein Molekülpeak sichtbar dafür Strukturinformation durchdie Fragmentierung!

  38. Isotopenpeaks beachten C2 H6 O Si Um welches Polymer könnte es sich handeln? Die beobachteten Ionen sind NH4+-Anlagerungen. Abstand betrachten 74.0188

  39. 13+ 14+ 12+ 15+ 11+ 8+ 7+ 10+ 9+ Grosse Moleküle unter ESI-Bedingungen Beispiel Cytochrom C Δm/z = 1/15 = 0.0666

  40. Normal(scan)betrieb eines „Triplequads“ Ionenquelle Quadrupol 1 Stosskammer Quadrupol 2 Detektor Tochterionenmodus Ionenquelle Quadrupol 1 Stosskammer Quadrupol 2 Detektor Fragmentierung Nur ein m/z MS-MS Experiment –Daughter ions

  41. Gegenüberstellung EI ESI EI ESI

  42. Musteranalyse 1 Flüssigkeit leicht löslich in Methanol ESI Zugabe von NH4OAc MW 162 Gerade Zahl von N Nicht basisch

  43. Musteranalyse 1 Mögliche Summenformeln für m/z 163bei einer Genauigkeit von +- 0.3 DaNur C,H,O zugelassen. Tochterionenspektrum von m/z 180 -46 -44 180-NH3 Anwesenheit von Heteroatmen

  44. Musteranalyse 1 Messung der exakten Massen Damit ist die Summenformel der neutralenVerbindung als C8H18O3 bestimmt Sie enthält keine Doppelbindungen oder Ringe Im Tochterionenspektrum war kein H2OVerlust sichtbar. Vermutlich handelt es sichum einen Ether.

  45. Musteranalyse 1 Tochterionenspektrum mit exakter Massenbestimmung -C2H6O = Ethanol -C2H4O symmetrisch?

  46. Musteranalyse 1 GC-MS-EI

  47. Musteranalyse 1 EI Spektrum z.B. mit GC Einlass Spektrensuche in der NIST-Datenbank (200000 Spektren) Vergleichsdarstellung mit dem besten Treffer MW 162

  48. Musteranalyse 2 Wasser/Methanol-lösliche Substanz • enthält eine aromatische Carbonsäure (als Ester) • enthält einen (?) Zuckerrest • enthält Quercetin (en Flavonoid) trägt am Ring Substituenten Methode ESI oder HPLC-ESI-MS C6H12O6 oder C5H10O5 C28 H25 O16 DBE 16.5 Abweichung -0.101mDa

  49. Musteranalyse 2 MS-MS (Tochterionen) HCD trägt am Ring Substituenten C6H12O6 oder C5H10O5 Die Gallussäure und der Zucker müssen miteinander verbunden sein

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