RFLP Restrictiefragment-lengte polymorfisme

1. RFLPRestrictiefragment-lengte polymorfisme J. Smeets - A. Leen

2. Principe CGGAGGTGCGCATACTGACCGCGGTATACTAG GCCTCCACGCGTATGACTGGCGCCATATGATC DNA Restrictie-enzym zal DNA verknippen

3. 8 basenparen 21 basenparen 5 basenparen CGTATACT GCATATGA CGACCGCGGTATACTAGTCCT GCTGGCGCCATATGATCAGGA CGGAG GCCTC In dit geval ontstaan er 3 DNA-fragmenten met verschillende lengte, dus met een verschillend aantal basenparen. In de praktijk kan het aantal basenparen in 1 fragment zeer hoog zijn, bijvoorbeeld 15 630 basenparen (bp). Een enzym zal bijvoorbeeld het DNA verknippen in het midden van de sequentie CT CG GA GC

4. Elektroforese Referentiestaal met gekende DNA-fragmenten van bijvoorbeeld 10, 20 en 30 basenparen. Negatief geladen Kleurstof Ons DNA-staal putje Agarose-gel putje

5. Elektroforese - - - - - pool - - - - - Ons DNA-staal + kleurstof Referentiestaal + kleurstof Kleurstof is negatief geladen en zal naar de positieve pool migreren. Alzo kan men op zicht het proces volgen. De DNA-fragmenten (die ook negatief geladen zijn) zullen ook migreren, maar deze fragmenten kunnen we niet zien! + + + + + pool + + + + +

6. 30 basenparen 20 basenparen 10 basenparen DNA wordt zichtbaar onder UV-licht DNA zichtbaar maken RESULTAAT Ons DNA-staal Referentiestaal ? basenparen 21 8 ? basenparen ? basenparen 5 Alzo kan men a.h.v. het referentiestaal het aantal basenparen van onze DNA-fragmenten schatten.

7. Toepassing 1: CRIMINOLOGIE Verdachte A B C DNA(vb. in bloed) aangetroffen op slachtoffer Alzo kan men patronen vergelijken en conclusies trekken. Voorzichtigheid is geboden!

8. Toepassing 2: ERFELIJKE ZIEKTEN OPSPOREN Gezond persoon Persoon met ziekte Alzo kan men patronen vergelijken en hiermee bijvoorbeeld stofwisselingsziekten opsporen.

9. 600 bp 600 bp 400 bp 300 bp 300 bp 280 bp 240 bp 240 bp 240 bp 200 bp 10 bp 10 bp 10 bp Toepassing 3: dier- of plantensoorten vergelijken Soort A Soort B Soort C basensubstitutie Deletie Men vergelijkt soorten op erfelijke basis. Doel: mutaties zoeken en evolutielijnen opstellen.

10. Aansluitend practicum. Vliebergh Sencie 1999 Mutaties zoeken Werken met papieren DNA-modellen. Een schaar gebruiken als restrictie-enzyme. Mogelijke verklaringen geven voor deze mutaties: deletie, insertie, substitutie (inversie).

11. DNA-monsters worden behandeld met een bepaald enzym: restrictie-endonuclease. Hiervan zijn er nu al meer dan honderd verschillende bekend. Elk enzym herkent een welbepaalde opeenvolging van 4 tot 5 basen in het DNA en zal het DNA telkens ter hoogte van een dergelijke sequentie “doorknippen”. Daarom worden ze ook wel knipenzymen genoemd. Zo ontstaat voor elk behandeld DNA-monster een verzameling van fragmenten met verschillende lengte. Via elektroforese kan men dan deze fragmenten van elkaar scheiden.

12. Als er wijzigingen optreden (mutaties) in het DNA, zal de basenvolgorde anders zijn en kunnen er, na gebruik van restrictie-enzymen, fragmenten ontstaan die een andere lengte hebben. Alzo zullen de elektroforesebeelden er anders uitzien; er ontstaat een zogenoemd polymorfisme (veelvormigheid). Vandaar de naam van de methode: RESTRICTIEFRAGMENT-LENGTE POLYMORFISME. Gedurende de evolutie van een soort ontstaan er in het DNA mutaties, waardoor individuen ontstaan die genetisch verschillend zijn. Voorbeelden van mutaties zijn o.a. de omzetting van een base in een andere (basensubstitutie) of het bijkomen (insertie) of verdwijnen (deletie) van één of meerdere basen in het DNA.

13. Benodigdheden • lange papieren strook waarop in grote letters de basenpaaropeenvolging van een kort dubbelstrengig DNA-molecule staat afgebeeld. • scharen (= ‘knipenzymen’). • blad papier.

14. Werkwijze • leerlingen moeten zich als knipenzymen gedragen. Hiervoor overlopen zij de DNA-streng van links naar rechts en knippen het dubbelstrengig DNA-molecuul in het midden van een bepaalde herkenningssequentie door. Sommige leerlingen kunnen als knipenzym A functioneren, anderen als enzym B. Beiden hebben een andere herkenningssequentie. Alle DNA-moleculen worden met beide enzymen bewerkt. • op een blad papier kan men een XY-assenkruis tekenen. Op de Y-as kunnen dan nummers (aantal basenparen) aangebracht worden, overeenkomend met de lengte van de fragmenten. Op de X-as kunnen bijvoorbeeld vier condities aangebracht worden (bv DNA I verknipt met enzym A, DNA II verknipt men enzym A, DNA I verknipt met enzym B, DNA II verknipt met enzym B) • zoek mogelijke verklaringen voor de resultaten • controleer je hypothesen (bv leg de fragmenten met 10 bp en 7 bp op de juiste manier achter elkaar en vergelijk met fragment met 17 bp)

15. Aantal bp 26 23 21 10 7 5 26 21 17 4 22 23 13 18 20 18 13 10 23 8 12 10 8 + 8 Vergelijking DNA I en DNA II 30 20 10 0 DNA I knipenzym A DNA II knipenzym A DNA II knipenzym B DNA I knipenzym B

16. Conclusie • via vergelijking van de lengte van bepaalde fragmenten kan men bepaalde soorten mutaties als mogelijke oorzaken aangeven • niet alle fragmenten met dezelfde lengte hebben noodzakelijk dezelfde basenvolgorde • fragmenten met dezelfde lengte bevinden zich op eenzelfde plaats op het elektroforesebeeld

17. Einde