江苏师范大学生命科学学院《卓培班》微生物学实验吕爱军 2013 年 3 月

江苏师范大学生命科学学院 《卓培班》微生物学实验吕爱军 2013年3月

基础综合实验一 1.培养基的制备及高压蒸汽灭菌 2. 器皿的清洗包装及干热灭菌 3. 实验室环境和人体表面微生物的检查 4. 无菌接种技术

1.培养基制备及高压蒸汽灭菌 牛肉膏 0.3g 蛋白胨 1g NaCl 0.5g 琼脂 2g 水 100ml PH 7.2-7.4 培养基配方：牛肉膏蛋白胨固体培养基：加1.5-2％琼脂 400ml 牛肉膏蛋白胨培养基：液体培养基 200ml

(1)培养基的配制： 先将试管贴好标签。注明培养基名称，组别，日期。标签粘贴位置在离管口1/3管身处。注意：标签用铅笔书写，以防高温灭菌时蒸汽模糊字迹。操作图示：称量---溶解----调节pH值----过滤----分装及包扎----灭菌----灭菌后试管摆放斜面、倒平板

(2) 高压蒸汽灭菌 一般培养基用0.1Mpa，121.5℃,15～30min 实验步骤：灭菌时间到后断电源压力降为零开箱取物加水装待灭菌物品加盖加热

摆斜面

倒平板 将菌液分离样品摇匀，用无菌移液管取1 ml的菌液移至无菌培养皿中，然后将融化，凉至50℃左右的培养基，在每个培养皿内各倒入约15 ml，摇匀，凝固，制成平板。

2. 器皿的清洗包装 及干热灭菌 (1) 培养皿、三角锥瓶、试管的包扎

(2)干热灭菌法 所需温度(160-170℃)，时间长(1-2h)。实验步骤: 装入待灭菌物品升温恒温降温开箱取物

3. 实验室环境和人体表面微生物的检查 (1)写标签：在皿底上 (2)接种环境或体表微生物手指（洗前后）、头发、咳嗽、抹布、空气、硬币等 (3)培养：37 ℃培养24h-48h

4. 微生物接种技术 常用的几种方法如下：斜面接种液体接种平板接种

1)斜面接种示意图

2)平板划线法： 将菌液分离样品摇匀，以无菌操作用接种环直接取试管中待分离纯化的菌液，将接种环通过稍打开皿盖的缝隙（约30℃）伸入平板，将菌液点种在平板边缘一处，取出接种环，烧去多余的菌种，在平板边缘空白处接触一下使接种环冷却,然后从接种有菌的部位在平板上自左向右轻轻划线，划线时平板面与接种环面成30-40℃，以手腕力量在平板表面轻巧滑动划线,接种环不要嵌入培养基内划破培养基,线条要平行密集，充分利用平板表面积，注意勿使前后两条线重叠，划线完毕，关上皿盖.灼烧接种环，待冷却后放置接种架上。

基础综合实验二 • 1.细菌的单染色 • 2. 革兰氏染色 • 芽孢染色 • 4. 酵母菌形态观察、死活细胞鉴别

涂片干燥固定染色水洗干燥镜检 无菌操作 1.细菌的单染色现场演示

显微镜保养和使用中的注意事项 1.不准擅自拆卸显微镜的任何部件,以免损坏。 2.镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，以保证光洁度 3.观察标本时，必须依次用低、中、高倍镜，最后用油镜。当目视接目镜时，特别在使用油镜时，切不可使用粗调节器，以免压碎玻片或损伤镜面。 4.拿显微镜时，一定要右手拿镜臂，左手托镜座，不可单手拿，更不可倾斜拿。

1.低倍镜观察：粗调、细调。依次再进行中倍、高倍观察1.低倍镜观察：粗调、细调。依次再进行中倍、高倍观察 2.油镜观察：高倍镜下找到清晰的物象后，提升聚光镜，在标本中央滴一滴香柏油，使油镜镜头浸入香柏油中，细调至看清物象为止。 3.换片：另换新片，必须从第一条开始操作。 4.用后复原：观察完毕，上悬镜筒，先用擦镜纸擦去镜头上的油，然后再用擦镜纸沾取少量去污剂擦去残留的油，最后用擦镜纸擦去残留的二甲苯，后将镜体全部复原。注意：油镜使用完毕后一定要用去污剂擦拭镜头显微镜操作

2. 革兰氏染色 （1）初染：于制片上滴加结晶紫染液，染1min后，用水洗去剩余染料。（2）滴加卢戈氏碘液，1min后水洗：（3）滴加95％乙醇脱色，摇动玻片至紫色不再为乙醇脱退为止(根据涂片之厚薄需时30s至1min)。（4）复染滴加石炭酸复红液复染1min，水洗。（5）用滤纸吸干，油镜镜检。制片→初染（结晶紫1min）→水洗→媒染（碘液1min）→水洗→脱色（乙醇20-30s）→水洗→复染（番红2min）→水洗→干燥→观察

3.芽孢染色法 (1)取37℃培养18～24h的枯草芽孢杆菌作涂片，并干燥，固定。 (2)于载片上滴入3～5滴5％孔雀绿水溶液。 (3)用试管夹夹住载玻片在火焰上用微火加热，自载玻片上出现蒸汽时，开始计算时间约4～5min。加热过程中切勿使染料蒸干，必要时可添加少许染料。 (4)倾去染液，待玻片冷却后，用自来水冲洗至孔雀绿不再褪色为止。 (5)用0.5％沙黄水溶液(或0.05％碱性复红)复染1min，水洗。 (6)制片干燥后用油镜观察。芽孢呈绿色，菌体红色。

芽孢染色 切勿煮干制片→染色（孔雀绿5min）→水洗→复染（蕃红花红2-3min）→水洗→干燥→镜检

4.酵母菌形态观察、 死活细胞鉴别（美蓝浸片）染液不宜过多或过少 • 在载玻片中央加一滴0.1％吕氏碱性美蓝染色液，用接种环挑取少量酵母菌苔放入上述液滴里，混合均匀；盖玻片不宜平着放下 • 用镊子取一块盖玻片，先将一边与菌液接触，然后慢慢将盖玻片放下使其盖在菌液上；

将制片放置约3min，先低倍镜后高倍镜观察酵母形态和出芽情况，并根据颜色区别死活细胞。将制片放置约3min，先低倍镜后高倍镜观察酵母形态和出芽情况，并根据颜色区别死活细胞。 • 染色30min后再次观察，注意死活细胞数量的变化； • 用0.05％的吕氏碱性美蓝染色液重复上述操作。

综合设计实验三 1.细菌的分离鉴定； 2.细菌生理生化试验； 3.药敏试验； 4.16S rRNA基因的克隆测序。

江苏师范大学生命科学学院《卓培班》微生物学实验吕爱军 2013 年 3 月