Etude de la diversité des allergènes de l’arachide

1. Etude de la diversité des allergènes de l’arachide Lucie Mondoulet 3° année de thèse Unité d’Immuno-Allergie Alimentaire, CEA Saclay Colloque des jeunes chercheurs INRA, Jouy-en-Josas 30 mai 2005

2. Mécanismesdel’allergiealimentaire 1° phase : sensibilisation 2° phase : déclenchement • Les marqueurs de l’allergie alimentaire : les IgE • Les acteurs : les protéines reconnues par les IgE (les allergènes)

3. Méthodologie A. Extraction des protéines par combinaison de tampons d’extraction B. caractérisations des protéines • Par approche globale : • protéomique • Protéine par protéine : • Purification par combinaison de précipitation et de chromatographies • Identification par séquençage et spectrométrie de masse • 3. Etude du potentiel allergénique des protéines • 80 sérums de patients allergiques à l’arachide • ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay)

4. Cartographie bidimensionnelle de l’arachide fragment Gly1 Globuline 7S MM (kDa) Ara h 1 188 98 62 fragment Gly1 49 Globuline 11S 38 Fragment Gly1 28 17 14 Fragment Gly1 6 pH 3 10 Ara h 6 Ara h 2 Albumine 2S

5. MM (kDa) 188 98 62 49 38 28 17 14 6 pH 10 3 Protéines purifiées Représentation bidimensionnelle Ara h 1 (globuline 7S) 65 kDa Fragments Gly1 (globuline 11S) De 10 à 50 kDa Ara h 2 (albumine 2S) 16,7 et 18 kDa Ara h 6 (albumine 2S) 14,8 kDa

6. Fréquence de réponse IgE spécifique ND : non déterminé • Toutes les protéines sont reconnues par les IgE de patients allergiques à l’arachide • Fort pourcentage de reconnaissance, excepté protéine XI

7. Intensité de réponse IgE spécifique population n=80 Fragments de Gly 1 Globuline 7S Albumine 2S Globuline 11S • Intensité de réponse importante pour les 3 familles de protéines végétales

8. Conclusion • Multiplicité des allergènes de l’arachide • Différentes familles de protéines de plantes : albumines 2S, globulines 7S et 11S • Diversité de la réponse IgE • Toutes les entités purifiées sont reconnues par les IgE de patients allergiques à l’arachide • Potentiel allergénique de l’arachide non modifié à la suite de: • Traitements thermiques • Processus digestifs

9. Devenir du potentiel allergénique de l’arachide lors des traitements thermiques et des processus digestifs Traitements thermiques Processus digestifs in vivo • Pas de modification du contenu protéique • Hydrolyse des protéines en fragments peptidiques de faible MM (< 3,5 kDa) • Pas de modification du potentiel allergénique • Peu de modification du potentiel allergénique IC50

10. Electrophorèse bidimensionelle 1ère dimension Électrofocalisation Ө 

11. Electrophorèse bidimensionelle 1ère dimension Électrofocalisation 2ème dimension gel dénaturant (SDS PAGE) Ө Ө  

12. Electrophorèse bidimensionelle Révélation : Coloration bleu de Coomassie 1ère dimension Électrofocalisation 2ème dimension gel dénaturant (SDS PAGE) Séparation selon pHi Ө Ө Séparation selon PM   • Transfert du gel possible pour réaliser des WB

13. 1h, 37°C banques de données (Swiss Prot, NCBI) par MS FIT, Profound… Analyse protéomique trypsine Obtention de peptides trypsiques Analyse par spectrométrie de masse (MALDI TOF) Carte peptidique Identification de la protéine et du recouvrement peptidique

14. ELISA IgE spécifique IgE IgE spécifique IgE spécifique IgE spécifique lavage Reconnaissance de l’allergène Ajout d’un anticorps monoclonal anti-IgE humaine marqué à l’AChE Proteins of whole peanut extracts 414 nm L’activité enzymatique est quantifiée par réaction colorimétrique en utilisant le réactif d’Ellman anti-IgE* Révélation de ce complexe