1 / 59

DNR REPARACIJA, REKOMBINACIJA IR TRANSPOZICIJA

DNR REPARACIJA, REKOMBINACIJA IR TRANSPOZICIJA. 8.1 DN R REPARACIJA. Kadangi dauguma mutacijų yra žalingos, DNR reparacijos sistemos yra gyvybiškai svarbios organizmo išgyvenimui Ląstelėse yra keletas DNR reparacijos sistemų, ištaisančių skirtingų tipų DNR pažaidas

alaina
Download Presentation

DNR REPARACIJA, REKOMBINACIJA IR TRANSPOZICIJA

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. DNR REPARACIJA, REKOMBINACIJA IR TRANSPOZICIJA

  2. 8.1 DNR REPARACIJA • Kadangi dauguma mutacijų yra žalingos, DNR reparacijos sistemos yra gyvybiškai svarbios organizmo išgyvenimui • Ląstelėse yra keletas DNR reparacijos sistemų, ištaisančių skirtingų tipų DNR pažaidas • Daugeliu atveju DNR reparacija yra daugiapakopis procesas • 1. Surandama DNR struktūros anomalija • 2. Nenormali DNR pašalinama • 3. Sintetinama normali DNR 8-2

  3. Dažniausi DNR reparacijos tipai 8-3

  4. Pažeistos bazės gali būti reparuojamos tiesiogiai • Keletu atvejų nukleotidų kovalentinės modifikacijos gali būti tiesiogiai pašalintos, veikiant specialiems fermentams • Fotoliazė gali reparuoti timino dimerus • Ji perskelia dimerus, atstatydama normalią DNR struktūrą • O6-alkilguanino alkiltransferazė reparuoja alkilintas bazes • Ji perneša metilo ar etilo grupę nuo bazės ant alkiltransferazės baltymo cisteino • Ši reakcija negrįžtamai inhibuoja alkiltransferazę 8-4

  5. Tiesioginė pažeistų DNR bazių reparacija DNR fotoliazė kerpa dvi jungtis tarp timino dimero Alkiltransferazė katalizuoja alkilo grupės pašalinimą Atstatoma normali dviejų timinų struktūra Atstatoma normali guanino struktūra b) Metilintos bazės tiesioginė reparacija a) Tiesioginė timino dimero reparacija 8-5

  6. Bazių ekscizijos reparacija pašalina pažeistą DNR • Bazių ekscizijos reparacijoje (BER)dalyvauja fermentai, priklausantys DNR-N-glikozilazių klasei • Šie fermentai gali atpažinti nenormalią bazę ir suardyti jungtį tarp jos ir DNR karkaso dezoksiribozės • Priklausomai nuo rūšies ši reparacijos sistema gali pašalinti tokias nenormalias bazes, kaip: • Uracilą; timino dimerus • 3-metiladeniną;7-metilguaniną 8-6

  7. N-glikozilazė atpažįsta nenormalią bazę ir nukerpa jungtį tarp bazės ir fosfodezoksiribozinio karkaso Priklausomai nuo to, kas yra pašalinamas – purinas ar pirimidinas, susidaro apurininiai arba apirimidininiai saitai Apirimidininis nukleotidas AP endonukleazė atpažįsta trūkstamą bazę ir kerpa DNR karkasą trūkstamos bazės 5’ pusėje DNR polimerazė naudoja 5’-3’ egzonukleazinį aktyvumą pažeistai sričiai pašalinti; susidariusi spraga užpildoma normaliais nukleotidais; ligazė susiuva srities kraštus Įkarpa Įkarpos replikacija (nick replication) būtų tikslesnis terminas 8-7 Įkarpos transliacijos regionas

  8. Nukleotidų ekscizijos reparacija pašalina pažeistos DNR segmentus • Svarbus bendrasis DNR reparacijos procesas yra nukleotidų ekscizijos reparacija (NER) • Šis reparacijos tipas gali reparuoti daugelį skirtingų DNR pažaidų tipų, tarp jų • timino dimerus ir chemiškai modifikuotas bazes • NER yra randama visuose prokariotuose ir eukariotuose • Jos molekuliniai mechanizmai geriau ištyrinėti prokariotų ląstelėse 8-8

  9. Nukleotidų ekscizijos reparacija pašalina pažeistos DNR segmentus • E. coli NER sistemai veikti reikia keturių pagrindinių baltymų • Jie žymimi UvrA, UvrB, UvrC ir UvrD • Pavadinti taip dėl to, kad dalyvauja ultravioleto šviesos indukuotų timino dimerų reparacijoje • Jie taip pat dalyvauja reparuojant chemines DNR pažaidas • UvrA, B, C ir D atpažįsta ir pašalina trumpą pažeistos DNR segmentą • DNR polimerazės ir ligazė baigia reparacijos procesą 8-9

  10. Timino dimeras UvrAB kompleksas slenka DNR, ieškodamas DNR pažaidų Aptikus pažaidą, UvrA yra pašalinami, o vietoje jų prisijungia Uvr C Uvr C padaro įpjovas abiejose timino dimero pusėse 8-10

  11. Dažniausiai įpjovos yra daromos 4-5 nukleotidų atstumu nuo pažaidos 3’galo ir 8 nukleotidų atstumu nuo 5’ galo Įpjova Įpjova Uvr D yra helikazė, pašalinanti pažeistą sritį. Uvr B ir C yra paleidžiami iš komplekso DNR polimerazė užpildo spragą, o DNR ligazė susiuva Timino dimero nebėra 8-11

  12. Nukleotidų ekscizijos reparacija pašalina pažeistos DNR segmentus • Keletas žmogaus ligų išsivysto dėl paveldimų defektų NER genuose • Šių ligų pavyzdžiai yra pigmentinė kseroderma (xeroderma pigmentosum; XP) ir Kokaino (Cockayne) sindromas (CS) • Abiejų sindromų būdingas bruožas yra jautrumas Saulės šviesai • Pigmentinę kserodermą gali sukelti defektai septyniuose skirtinguose NER genuose 8-12

  13. Neatitikimo reparacijos sistema aptinka ir ištaiso bazių porų neatitikimus • Bazių neatitikimasyra dar viena DNR struktūros anomalija • DNR dvigubos spiralės struktūra paklūsta AT/GC bazių poravimosi taisyklei • Tačiau DNR replikcijos metu dėl klaidos gali būti įjungta netatitinkanti poros bazė • DNRpolimerazei būdinga 3’-5’ korekcijos savybė, dėl kurios yra aptinkamas ir ištaisomas bazių neatitikimas 8-13

  14. Neatitikimo reparacijos sistema aptinka ir ištaiso bazių porų neatitikimus • Tačiau jei ši korekcija nesuveikia, tada pradeda veikti metilo nukreipiama bazių neatitikimo reparacijos sistema • Ši reparacijos sistema randama visose organizmų rūšyse. Tai rodo jos gyvybinę svarbą • Žmogaus irganizme šios sistemos defektai yra siejami su kai kurių tipų navikų išsivystymu 8-14

  15. Neatitikimo reparacijos sistema aptinka ir ištaiso bazių porų neatitikimus • Molekuliniai bazių neatitikimo reparacijos mechanizmai geriausiai ištyrinėti E. coli • Dalyvauja trys baltymai - MutL, MutH ir MutS • Baltymai pavadinti “Mut”, kadangi jiems nesant mutacijų dažnis yra žymiai didesnis • Pagrindinė MutH ypatybė yra ta, kad jis gali atskirti tėvinę grandinę nuo dukterinės • Tėvinė grandinė yra metilinta, o dukterinė kol kas nemetilinta 8-15

  16. MutS baltymas aptinka neatitikimą. MutS/MutL kompleksas prisijungia prie MutH, kuris jau yra prisijungęs prie hemimetilintos srities Tėvinė grandinė Veikia kaip jungtis tarp MutS ir MutH Nauja grandinė Neatitinkanti bazė MutH daro įpjovą nemetilintoje grandinėje. Egzonukleazė šioje vietoje pradeda skaidyti nemetilintą DNR ir sustoja iš karto už bazių neatitikimo MutH kirpimo vieta Metilo nukreipiama bazių neatitikimo reparacija E. coli 8-16

  17. MutH kirpimo vieta DNR polimerazė užpildo spragą, DNR ligazė susiuva galus Neatitinkanti bazė reparuota Metilo nukreipiama bazių neatitikimo reparacija E. coli 8-17

  18. Pažeista DNR gali būti reparuojama rekombinacijos būdu • Kai kurie DNR pažaidų tipai gali sustabdyti DNR replikaciją • Pavyzdžiui, timino dimeras sustabdo suporuotos bazės įjungimą į naujai susintetintą dukterinę grandinę • Susidaro replikacijos spraga • Dėl šios spragos gali susidaryti chromosomų aberacijos ir kitos mutacijos • Tačiau šias spragas gali užpildyti rekombinacinė reparacija 8-18

  19. DNRgrandinės A ir C turi tas pačias sekas DNRgrandinės B ir D turi tas pačias sekas Vykstant rekombinacijai, A grandinės sritis yra pakeičiama C grandinės tokia pačia sritimi Pastaba: Rekombinacinė reparacija vyksta tada, kai jau yra dvi DNR kopijos 8-19

  20. Spraga, esant A grandinėje, užpildoma DNR polimerazės ir DNR ligazės, panaudojant B grandinę kaip matricą Spraga reparuojama, tačiau timino dimeras išlieka 8-20

  21. Aktyviai transkribuojamos DNR reparacija • Ne visa DNR yra reparuojama vienodai intensyviai • Aktyviai transkribuojami prokariotų ir eukariotų genai yra reparuojami efektyviau, negu netranskribuojama DNR • DNR reparacijos fermentų pirmaeilis nukreipimas į aktyviai transkribuojamus genus suteikia keletą biologinių pranašumų • 1. Aktyvių genų DNR struktūra yra mažiau kompaktiška • Todėl tokie genai yra jautresni DNR pažeidžiantiems veiksniams • 2. DNR sritys, tyrinčios aktyvių genų, yra svarbesnės išgyvenamumui, negu netranskribuojamos sritys 8-21

  22. Aktyviai transkribuojamos DNR reparacija • E. colibaltymas, vadinamastranskripciją ir reparaciją sujungiančiu faktoriumi (transcription-repair coupling factor; TRCF)tarpininkauja tarp DNR reparacijos ir transkripcijos • Jis nukreipia NER sistemą į aktyviai transkribuojamus genus, turinčius pažeistą DNR • Ši sistema eukariotuose yra ištyrinėta menkiau; nustatyta keletas baltymų, galinčių atlikti TRCF funkciją • Šie baltymai nustatyti tiriant individus, pasižyminčius dideliu mutacijų dažniu • Pvz., tiriant Kokaino sindromą identifikuoti du genai – CS-A ir CS-B, koduojantys baltymus, veikiančius kaip TRCF 8-22

  23. TRCF RNR polimerazė Timino dimeras Timino dimeras sustabdo RNR polimerazę TRCF veikia kaip helikazė ir pašalina RNR polimerazę iš pažeistos srities RNR polimerazė (turi UvrA jungimosi vietą) Uvr A/B kompleksas pritraukiamas, o TRCF paleidžiamas Vyksta NER reparacija 8-23

  24. Pažeistą DNR gali replikuoti pažaidas apeinančios DNR polimerazės • Kai kurios pažaidos išvegia visų reparacijos sistemų ir lieka DNR • Jos taip pat gali “išgyventi” ir iki DNR replikacijos • Replikacinės DNR polimerazės, tokios, kaip E. coliDNR pol III yra jautrios DNR struktūros pokyčiams • Todėl jos negali vykdyti replikacijos, jei DNR struktūra yra pažeista • Pažeistos DNR replikacijai reikalingos specializuotos DNR polimerazės 8-24

  25. Šie specializuoti fermentai padeda vykti apeinančiai pažaidas DNRsintezei, (translesion DNA synthesis; TLS) • TLS polimerazės turi aktyvų centrą su laisva, paslankia kišene • Todėl jos gali prisitaikyti prie aberantinių struktūrų, esančių matricinėje grandinėje • Neigiama TLS polimerazių savybė yra žemas replikacijos tikslumas • Klaidų (mutacijų) dažnis svyruoja nuo 10-2iki 10-3 • Kai replikacinė DNR polimerazė aptinka pažeistą DNR sritį, ji užleidžia vietą TLS polimerazei 8-25

  26. E. coliapeinanti pažaidas replikacijavyksta esant ekstremalioms sąlygoms, kurias skatina DNR pažaidos • Šis reiškinys yra vadinamas SOSatsaku • Jo metu pradeda veikti keletas genų, kurių produktai reparuoja DNR, atstato replikaciją ir sustabdo priešlaikinį ląstelių dalijimąsi • Nereparuota pažeista DNR yra replikuojama DNR polimerazių II, IV ir V 8-26

  27. 8.2 DNR REKOMBINACIJA • Genetinės rekombinacijos metu formuojasi chromosomų trūkiai, o susidarę fragmentai jungiasi, sudarydami naujas kombinacijas • Skiriami trys pagrindiniai rekombinacijos tipai • 1. Homologinė rekombinacija • Vyksta tarp homologinių DNR segmentų • Būdinga visiem organizmams • 2. Saitspecifinė rekombinacija • Vyksta rekombinuojant nehomologiniams DNR segmentams specifinėse vietose (saituose) • 3. Transpozicija • Vyksta kai maži DNR segmentai, vadinami transpozonais, persikelia į įvairias chromosomų vietas 8-27

  28. Eukariotų chromosomų krosingoveris 8.2.1 Homologinė rekombinacija • Mejozės I ir retkarčiais mitozės metu vyksta krosingoveris • Tai yra DNR mainai tarp homologinių chromosomų neseserinių chromatidžių; jie sukuria naujas alelių kombinacijas • Anksčiau minėti seserinių chromatidžių mainai nesukuria naujų alelių kombinacijų, todėl nėra laikomi genetinės rekombinacijos forma Taip pat vadinami netėviniais genotipais 8-28

  29. Genų konversijos priežastys • Kartais genetinė rekombinacija du skirtingus alelius paverčia dviem identiškais aleliais • Procesas, kai vienas alelis yra paverčiamas kitu aleliu, yra vadinamas genųkonversija • Genų konversija gali atsirasti dviem būdais • 1. DNR spragų reparacinės sintezės metu • 2. Vykstant DNRbazių neatitikimo reparacijai 8-29

  30. Genų konversija, vykstanti spragų reparacijos metu Viršutinė chromosoma turi recesyvinį b alelį, o apatinė chromosoma dominuojantį B alelį Geno sritis Įvyksta dvigrandinis trūkis recesyviniame gene Sritis, gretima dvigrandininiam trūkiui, Iškerpama, o tai pašalina recesyvinį b alelį Baltymas RecA skatina grandinės invaziją ir D kilpos formavimąsi 8-30

  31. Genų konversija, vykstanti spragų reparacijos metu Reparacinės sintezės metu dominuojančio B alelio DNR grandinė yra naudojama kaip matrica spragai užtaisyti Abidvi chromosomos turi B alelį 8-31

  32. 8.2.2 Saitspecifinė rekombinacija • Vykstant šiam procesui du mažai homologiški ar visiškai nehomologiški DNR segmentai gali rekombinuoti specifiniuose saituose • Šie saitai yra palyginti trumpos DNR sekos, nurodančios specifinę rekombinacijos vietą • Chromosomų fragmentų karpymą ir susijungimą katalizuoja specializuoti fermentai • Saitspecifinę rekombinaciją naudoja: • Kai kurie virusai – savo DNR įterpti į šeimininko DNR • Žinduoliai – antikūnų įvairovei sukurti 8-32

  33. Antikūnų įvairovę sukuria saitspecifinė rekombinacija • Antikūnaiarbaimunoglobulinai (Ig)yra baltymai, gaminami imuninės sistemos B ląstelių • Jų funkcija yra atpažinti svetimus darinius (virusus, bakterijs ir kt.) ir nukreipti juos sunaikinimui • Šie svetimi dariniai dar vadinami antigenais • Antigeno-antikūnoatpažinimas yra labai specifinis • Kiekvieno tipo antikūnas atpažįsta vieną epitopą • Kiekviena B ląstelė sintetina tik vieno tipo antikūnus • Tačiau organizme yra milijonai B ląstelių, sintetinančių skirtingus antikūnus 8-33

  34. Milijonų skirtingų antikūnų molekulių sintezė iškelia įdomų genetinį klausimą • Jei viskas vyktų pagal standartinį mechanizmą, organizmui reikėtų milijonų skirtingų antikūnų genų. Tuo tarpu visame žmogaus genome yra apie 35,000 genų (ar dar mažiau) • Taigi, kaip organizmai sukuria milijonus antikūnų molekulių su skirtingomis aminorūgščių sekomis polipeptiduose? • Išsivystė neįprastas procesas, kurio metu DNR yra kerpama ir susiuvama, vykstant saitspecifinei rekombinacijai • Šiam mechanizmui įgyvendinti pakanka tik keleto didelių antikūno pradinių genų • Jų DNR yra pertvarkoma daugeliu skirtingų būdų, taip sukuriant skirtingas aminorūgščių sekas 8-34

  35. Antikūnai yra tetrameriniai baltymai, sudaryti iš dviejų sunkių ir dviejų lengvų polipeptidinių grandinių Specifinių antigenų prisijungimo sritys Antigenas Variabili sritis Hipervariabili sritis Pastovios sritys Lengvoji grandinė Sunkioji grandinė 8-35

  36. Domenų išsidėstymas lengvosios grandinės pradiniame gene • Vienas lengvosios grandinės tipų yra k (kapa) lengvoji grandinė • Pradinį geną sudaro įvairios sekos arba domenai • Maždaug 300 variabilių domenų (V=Variable) • Kiekvienas koduoja skirtingas aminorūgščių sekas • Keturi sujungimo domenai(J=Joining) • Kiekvienas koduoja skirtingas aminorūgščių sekas • Vienas pastovus domenas(C=Constant) 8-36

  37. Vykstant B ląstelių diferenciacijai klengvosios grandinės pradinis genas yra sukarpomas ir sujungiamas taip, kad vienas V domenas yra sugretinamas su J domenu • Rekombinacijos signalo seka yra randama kiekvieno V domeno pabaigoje ir kiekvieno J domeno pradžioje • Ši vieta (saitas) dalyvauja saitspecifinėje rekombinacijoje • Rekombinaciją inicijuoja du baltymai - RAG1 ir RAG2 • Jų pavadinimas yra akronimas nuo recombination-activating gene 8-37

  38. Lengvosios grandinės pradinis genas RAG1 ir RAG2 katalizuoja trūkių susidarymą variabilaus domeno pabaigoje ir sujungimo domeno pradžioje. Pavyzdyje tai vyksta V78 pabaigoje ir J2 pradžioje Susjungimas nėra visiškai preciziškas, todėl keletas bazių gali būti įterptos arba pamestos sandūros srityje. Tai sukuria papildomą antikūnų įvairovę Tarpinė DNR pametama. NHEJ baltymas katalizuoja paskutiniojo V domeno ir pirmojo J domeno susijungimą Nonhomologous DNA end joining Genas transkribuojamas į mRNR pradedant paskutiniuoju variabiliu domenu 8-38

  39. Vyksta srities, esančios tarp pirmojo J domeno ir C domeno splaisingas mRNR yra transliuojama į polipetidą, sudarytą iš vieno V, vieno J ir vieno C domenų Du lengvųjų grandinių polipeptidai Ir du sunkiųjų grandinių polipeptidai sudaro funkcionalų antikūno baltymą Sunkiosios grandinės polipeptidas Funkcionalus antikūnas, susidarantis vienoje B ląstelėje 8-39

  40. Sunkiosios grandinės polipeptidai gali būti sukuriami, panaudojant panašų rekombinacijos mechanizmą • Sunkiosios grandinės pradinis genas turi • Apie 500 variabilių domenų • 4 sujungimo domenus • 12 įvairovės domenų (D=Diversity ), randamų tarp V ir J • Pradžioje kombinuojami D ir J • Po to vyksta V rekombinacija su DJ • Tie patys baltymai, katalizuojantys VJ susiliejimą, dalyvauja ir sunkiosios grandinės geno rekombinacijoje 8-40

  41. Visas šis procesas yra vadinamas V(D)J rekombinacija • (D) vyksta tik sunkiosios grandinės gene • V(D)J rekombinacija sukuria didžiulę polipeptidų įvairovę • Lengvoji grandinė • 300 (V domenų) X 4 (J domenai) = 1,200 galimų kombinacijų • Sunkioji grandinė • 500 (V domenų) X 12 (D domenų) X 4 (J domenai) = 24,000 galimų kombinacijų • Lengvosios ir sunkiosios grandinių kombinacijos sukuria • 1,200 X 24,000 = 28,800,000 galimų antikūnų molekulių!!! 8-41

  42. 8.2.3 Transpozicija • Transpozicijayra mažų DNR segmentų integracija į chromosomą • Tai gali vykti daugelyje skirtingų genomo vietų • Šie DNR segmentai yra vadinami transpozabiliais elementais (TE) • Kartais juos dar vadina “šokinėjančiais genais” (“jumping genes”) • TE pirmoji identifikavo Barbara McClintock, tyrinėdama kukurūzus • Po to buvo aptikta daugybė TE bakterijose, grybuose, augaluose ir gyvūnuose 8-42

  43. Transpozonų fenotipinė raiška augaluose • Kukurūzo grūdas su spalvotomis aleurono dėmėmis • Dėmės atsiranda dėl Ac-Ds sistemai priklausančių transpozonų • Žirnių požymis wrinkled, atsirandantis dėl traspozabilaus elemento insercijos į struktūrinį geną, koduojantį krakmolo sintezei reikalingą fermentą 8-43

  44. Transpozicijos būdai • Nustatyti trys pagrindiniai transpozicijos būdai • 1. Paprasta transpozicija • 2. Replikacinė transpozicija • 3. Retrotranspozicija 8-44

  45. a) Paprasta transpozicija • Šis mechanizmas taip dar vadinamas “cut-and-paste” • Plačiai aptinkamas bakterijose ir eukariotuose 8-45

  46. b) Replikacinė transpozicija • Vyksta TE replikacija ir kopijos insercija į kitą chromosomos vietą • Šis mechanizmas santykinai retas ir sutinkamas tik bakterijose 8-46

  47. Transkripcija Atvirkštinė transkriptazė c) Retrotranspozicija • Šis mechanizmas labai dažnas, tačiau sutinkamas tik eukariotuose • Šio tipo elementai vadinamiretroelementais, retrotranspozonaisarbaretropozonais (RE) 8-47

  48. TE būdingos specifinės DNR sekos • Transpozabilių elementų DNR sekos yra kelių tipų • Pagal tai, kokios sekos juos sudaro, skiriami šie pagrindinai TE tipai • Insercinės (įterptinės) sekos • Sudėtiniai transpozonai • Replikaciniai transpozonai • Retroelementai • Virusų tipo • Ne virusų tipo • Tačiau aptinkami ir įvairūs kiti TE struktūrų variantai 8-48

  49. a) Elementai, judantys po genomą paprastos transpozicijos būdu Invertuoti pasikartojimai Tiesioginiai pasikartojimai Katalizuoja transpoziciją Ilgis varijuoja nuo 9 iki 40 bp Randami šeimininko DNR Transpozazės genas Insercinė seka Paprasčiausias TE • Invertuoti pasikartojimaiyratokios pačios, tik priešingų krypčių, DNR sekos 5’ CTGACTCTT 3’ 3’ GACTGAGAA 5’ 5’ AAGAGTCAG 3’ 3’ TTCTCAGTC 5’ ir 8-49

  50. a) Elementai, judantys po genomą paprastos transpozicijos būdu Suteikia selektyvinį pranašumą Transpozazės genas Atsparumo antibiotikams genas Sudėtinis transpozonas • Turi papildomų genų, nereikalingų transpozicijai vykti • Tik dvi invertuotos kartotinės sekos transpozono galuose dalyvauja transpozicijoje 8-50

More Related