Reparacija DN K

1. Reparacija DNK • Kod svih organizama DNK se mora očuvati dok se ostali molekuli mogu zameniti • Raznovrsni reparacioni sistemi nastali tokom evolucije su rezultat raznovsnosti oštećenja koja nastaju na DNK • Većina reparacionih mehanizama se oslanja na komplementarnost baza i ne greši – error free • Mali broj mehanizama greši – error-prone

2. Oštećenja DNK i reparacioni sistemi • Isti reparacioni mehanizam ispravlja različita oštećenja • Veći broj reparacionih sistemaispravljačestaoštećenja

3. Mehanizmi DNKreparacije kod prokariota 1.Direktna reverzija oštećenja Dealkilacija - demetiluje O6-metilguanin Fotoreaktivacija – monomerizuje pirimidinske dimere 2. Eksciziona reparacija (reparacija isecanjem) - Ekscizija baza (BER) ispravlja abnormalne ili neodgovarajuće baze u DNK (uracil, hipoksantin, alkilirane ili oksidovane baze) - Ekscizija nukleotida (NER) ispravlja velike strukturne promene baza, pirimidinske dimere, prepoznaje distorziju heliksa - Mismatch repair (MMR) ispravlja greške u toku replikacije, pogrešno sparene baze 3. Rekombinaciona reparacija - ispravlja prekide u DNK 4. Mehanizmi tolerancije oštećenja - rekombinacija - DNK PolII zavisan bypassoštećenja, inducibilan - DNK PolIV i PolV zavisna replikacija oštećenja, translezijska sinteza, inducibilna

4. Dealkilacija • Alkilirajući agensi (MMS, EMS) • Enzim O6-metilguaninDNKmetiltransferaza(produktadagena) preuzima metil grupu sa O6-metilguanina što ga inaktivira

5. Fotoreaktivacija • UV (254 nm) dovodi do dimerizacije pirimidina • Enzim fotoliaza sa kofaktorom FADH2 prepozmaje pirimidinski dimeri vezujese • Kompleksapsorbuje kvantsvetlosti 300-500 nm i koristi energiju za razdvajanje dimera • Fotoliaza se oslobađa Postoji kod mnogih bakterija, biljaka i nekih životinja

6. Ekscizija baza - BER • Oksidativna deaminacija baza (C u U) • Specifične DNKglikozilaze – uklanjaju bazu (nastaje AP mesto) • APendonukleaze - raskidaju fosfodiestarsku vezu koja se nalazi 5' ili 3'od AP mesta • Nukleotidi uklonjeni egzonukleazom se zamenjuju reparativnom sintezom i ligacijom

7. Ekscizija nukleotida - NER • Prepoznavanje oštećenja (dimera) i vezivanje proteinskog kompleksa UvrA2B • Dve incizije na oštećenom lancu (5' i 3' od mesta oštećenja, UvrBC) • Uklanjanje oligonukleotida sa oštećenjem, UvrD • Popunjavanje nastalog prekida DNK polimerazom • Ligacija

8. Reparacija pogrešno sparenih baza - MMR • Metilacija GATC sekvenci Dam metilazom • MutS protein prepoznaje pogrešno sparenbazni par • MutH endonukleaza prepoznaje hemimetilovanu GATC sekvencu • Formira se MutS/MutL/MutHkompleks • MutH endonukleaza isecanemetilovanu GATC sekvencu • Lanac se degraduje egzonukleazama • DNK Pol III popunjava prekid • DNK ligaza povezuje lanac

9. Postreplikativna rekombinaciona reparacija RecA zavisan mehanizam za ispravku: • jednolančanih prekida(single-strand breaks- ssb) • dvolančanih prekida (double-strand breaks- dsb) Mehanizam za toleranciju oštećenja: • popunjavanje jednolančanih prekida u novosintetisanomlancu (daughter-strand gaps - dsg)

10. Translezijska sinteza - TLS • Inducibilni mehanizam uključen u toleranciju oštećenja • Replicira templet koji sadrži oštećenje • Jedan je od niza odgovora ćelije na oštećenje DNK (SOS odgovor) • Biološki smisao SOS odgovora je povećanje kapaciteta reparacije • TSL povećava preživljavanje, ali i genetičku varijabilnost

11. Model SOS indukcije kod E. coli • LexA represor sprečava ekspresiju gena SOS regulona (više od 20 gena) • Zaustavljanjem replikacije na oštećenju formira se signal za SOS indukciju (ssDNK). • RecA proteinse vezuje za ssDNK i aktivira se (RecA*) • RecA* ima koproteaznu ulogu, pomaže autokatalitičku razgradnju LexA represora • Povećava se ekspresija inhibitora ćelijskih deoba i nekih proteina koji učestvuju u NER i rekombinacionoj reparaciji • Eksprimiraju se polB (PolII), dinB(PolIV), i umuDC operon (PolV)

12. Pol V TLS • RecA*omogućava post-translacionu obradu UmuD proteina u aktivnu formuUmuD’ • Kompleks UmuD’2C je DNK Pol V koja vrši TLS • Replizom (Pol III) se zaustavlja na oštećenju • Zamena replizoma mutazomom (Pol V) • Translezijska replikacija, ugrađivanje nekomplementarnih nukleotida naspram oštećenja • Ponovno uspostavljanje replikacije

13. Pol II i Pol IV reparativni mrhanizmi • Pol II ima editorsku funkciju • Omogućava nastavak replikacije nekoliko minuta posle njenog zaustavljanja na oštećenju • Replication restart mehanizmom “pileće noge” • Pol IV nema editorsku funkciju – reparacija error-prone • Replicira AP mesta i velike adukte npr B(a)P • Ne može da kopira pirimidinske dimere

14. Pol II replication restart • Regresija replikativne viljuške pomoću RecA + RecFOR kompleksa • Pol II kopira neoštećeni novosintetisani lanac – struktura “pileće noge” • RecG vraća replikativnu viljušku • PriA omogućava nastavak replikacije Pol III

15. Fenotipska i genotipska promenljivost • Fenotipska promenljivost – adaptacija na uslove u kojima se jedinke nalaze, zahvata sve jedinke u populaciji, ne nasleđuje se • Genotipska promenljivost – promena u genotipu, zahvata retke jedinke u populaciji i nasleđuje se

16. Genetička varijabilnost Postojanje genetičke varijabilnosti u populaciji je neophodno za adaptaciju na izmenjene uslove sredine, opstanak i evoluciju živih organizama.

17. Mehanizmi genotipske promenljivosti • Mutacije – promene u broju i redosledu nukleotida u molekulu DNK • Rekombinacije – stvaranje nove kombinacije gena prenosom dela genetičke informacije iz jedne ćelije u drugu (horizontalni transfer gena) • Transpozicije – premeštanje jednog ili više gena sa jednog mesta na drugo ili sa jednog replikona na drugi

18. Mutacije • Promene u broju ili redosledu nukleotida u molekulu DNK • Obično imajuzaposledicuizmenuredosleda aminokiselina u proteinukoji postaje nefunkcionalan • Mutacije suredakislučajandogađaj i uglavnom imaju negativan efekat • Malibrojmutacijaomogućavaevolutivnepromene

19. Tipovi mutacija • Tačkaste mutacije - zamenebaznog para (tranzicije ili transverzije) i promeneokviračitanja • Delecije- gubitakbaznih parova • Adicije - dodavanje baznih parova • Insercije - umetanje većegbrojabaznih parova • Inverzije- isecanjedela DNKiumetanje u obrnutomsmeru • Duplikacije - oblikadicijakod kojih sudodati nizovi bazaidentični

20. Zamene baznog para - efekat na strukturu proteina

21. Vanfazne - frameshift mutacije

22. Upravne mutacije i reverzije Upravne mutacije – u divljem soju, gubitak funkcije Reverzije – nove mutacije koje uspostavljaju fenotip divljeg soja • Prave reverzije – nova mutacija je na istom mestu gde i prethodna • Supresije – nova mutacija je na drugom mestu ali poništava efekat prethodne • Intragenske supresije – nova mutacija u istom genu, npr. frameshift • Intergenske supresije – nova mutacija u drugom genu, npr supresija nonsense mutacije pomoću supresorskih tRNK

23. Spontane mutacije • Greške u replikaciji izazvane teutomerijom baza • “Proklizavanje” DNK Pol III na monotonim nizovima nukleotida • Replikacija ili reparacija endogenih oštećenja DNK (oksidativnaoštećenja, depurinacija, itd) Glavni mehanizmi u ćeliji koji kontrolišu nivo spontanih mutacija: • Selekcija baza i editorska funkcija DNK Pol III • Reparacija pogrešno sparenih baza – MMR • Redak događaj, u proseku 10-10 nukleotida

24. Indukovane mutacije • Izazvane brojnim hemijskim, fizičkim i biološkim agensima, mutagenima, koji mogu izazvati različita oštećenja u molekulu DNK i povećati stopu mutacija Glavni mehanizmi nastanka indukovanih mutacija: • Zamena purinske ili pirimidinske baze (bazni analozi) • Hemijska promena baze koja izaziva pogrešno sparivanje (alkilacija, oksidativna deaminacija) • Interkalacija (EtBr, akridin oranž) • Hemijska promena baze koja izaziva potpuni gubitak sposobnosti sparivanja (pirimidinski dimeri, adukti)

26. Fiksacija mutacija • Proces od nastanka oštećenja do nastanka mutacije • Potrebne dve replikacije za fiksaciju mutacija • U prvoj replikaciji naspram oštećenja dolazi do ugrađivanja nekomplementarnog nukleotida u novi lanac DNK • U drugoj replikaciji dolazi do kopiranja templeta sa pogrešnim nukleotidom i stvara se mutirana DNK

27. Posledice delovanja mutagena • Smrt ćelije • Ispravka oštećenja reparacionim mehanizmima koji ne greše • Replikacija oštećenja ili ispravka oštećenja reparacionim mehanizmima koji greše - indukcija mutacija • Manje od 1/1000 oštećenjaće biti fiksirano u mutaciju

28. Mutanti Jedinkekod kojih je došlo do mutacija i kojese fenotipski razlikuju od roditelja • Mutanti u morfologiji • Mutanti u ishrani (auksotrofi) • Mutanti rezistentni na antibiotike • Mutanti u reparaciji DNK • Uslovni mutantu

29. Izolovanje auksotrofnih mutanata tehnikom kopiranja

31. Ames-ov test za detekciju mutagena • Reverzni test na bakteriji S. typhimurium • Auksotrofni mutantiu histidinskom operonu • Reverzije his-→His+ (bazne zamene i frameshift-i) • Osetljivost povećana mutacijama u NER • Neki sojevi nose plazmid sa genima za mutagenu DNK polimerazu • Za imitiranje sisara dodaju se cytP450 enzimi jetre pacova (S9 frakcija) Bruce Ames

32. Na površinuagara sabakterijamapostavljajuse filter papirinatopljeni supstancom kojase testira Ukoliko je supstanca mutagenaokonatoplenog papiraće se pojaviti revertanti u većem broju nego oko kontrolnog filter papira Omogućava i testiranje toksičnosti potencijalnog mutagena “Spot” test

33. “Plateincorporation” test • Testirana supstanca i bakterije se dodaju u soft agari smeša se razliva napovršinupetri šolje • Na kontroloj petri šolji se umesto testirane supstance dodaje rastvarač • Ukoliko je supstanca mutagenapostojaće razlika u broju kolonija revertanata u kontrolnoj i test petri šolji