分子選殖（ molecular cloning ）

分子選殖（molecular cloning ） • 大綱 • 分子選殖技術 • 限制酶 • 載體 • 選殖基因的確認 • 基因庫的製作

分子選殖程技術（DNA重組技術）所需材料 標的DNA + 限制酶(restriction enzyme) + 接合酶(ligase) + 載體(vector) ↓ 轉型(transformation)至宿主(細菌)

電泳分析DNA 電泳分析PCR產物染色體DNA的抽取、載體的抽取 ↓ 引子設計、PCR標的基因（基因分析） ↓ 限制酶切割PCR標的基因與載體 ↓ 接合PCR標的基因與載體 ↓ 藍白篩選或選殖基因的確認（抽取質體以限制酶切割，確認插入DNA的大小） ↓ 重組基因之表現 ↓ 重組蛋白之純化 ↓ SDS-PAGE分析重組蛋白轉型

分子選殖實驗方法聖經 3rd Edition 2001 2nd Edition 1989 1st Edition 1982

2006

Chapter 1. Plasmids and Their Usefulness in Molecular Cloning • Chapter 2. Bacteriophage lambda and Its Vectors • Chapter 3. Working with Bacteriophage M13 Vectors • Chapter 4. Working with High-capacity Vectors • Chapter 5. Gel Electrophoresis of DNA and Pulsed-field Agarose Gel Electrophoresis • Chapter 6. Preparation and Analysis of Eukaryotic Genomic DNA • Chapter 7. Extraction, Purification, and Analysis of mRNA from Eukaryotic Cells • Chapter 8. In vitro Amplification of DNA by the Polymerase Chain Reaction • Chapter 9. Preparation of Radiolabeled DNA and RNA Probes • Chapter 10. Working with Synthetic Oligonucleotide Probes

Chapter 11. Preparation of cDNA Libraries and Gene Identification • Chapter 12. DNA Sequencing • Chapter 13. Mutagenesis • Chapter 14. Screening Expression Libraries • Chapter 15. Expression of Cloned Genes in Escherichia coli • Chapter 16. Introducing Cloned Genes into Cultured Mammalian Cells • Chapter 17. Analysis of Gene Expression in Cultured Mammalian Cells • Chapter 18. Protein Interaction Technologies

http://www.protocol-online.org/

載體 • 攜帶基因進入細菌體的物質 • 可在細菌複製與繁殖 • 細菌的質體(plasmid)與噬菌體(bacteriophage) • 宿主生物 • 最常用為細菌 • 細菌的質體易從細胞中分離，也容易進入細胞 • 生長快速 • 缺點：與真核生物轉錄與轉譯有些差別 • 後轉譯修飾-加上醣基或脂質

限制酶restriction enzyme • 原核生物所產生 • 保護原核生物免於外來DNA感染 • 1970 Johns Hopkins Hamiton Smith所分離 • 辨識DNA上特定的核苷酸序列 • 雙股DNA 4-8個核苷酸 • 雙股序列相同，方向相反，稱迴文序列palindromic sequence • 命名法：Hind III（Haemophilus infuenzae） • 第一個字母細菌的屬名genus • 第二、三字母細菌的種名species • 第四個字母細菌的strain • 羅馬數字為發現的順序

限制酶因切割位置不一樣有三種缺口 • 切出5’端突出的黏端5’-cohesive (sticky end) • 切出3’端突出的黏端3’-cohesive (Sac I) • 切出鈍端blunt-end

質體(Plasmid) • 復製原ori：才能在細菌中大量複製 • 耐抗生素基因：以利選殖出帶有此質體的細菌株 • 選殖位置(mutiple cloning sites)供選殖基因接入位置。 • 相同複製原的質體屬世同個不親和群體 • 當細菌中已經先有了某種質體，種製原和它相同的質體就不能再進入 • 複製原來源不同的質體，可以同時存在同一個細菌中

勝任細胞competent cells • 進行基因選殖時，不可能利用自然發生的接合現象來完成細菌轉型的步驟 • 改變細菌的細胞壁，增加細胞膜的通透性，讓質體很容易進入，這種細胞稱為勝任細胞(competent cell) • CaCl2化學處理 • 便宜簡單的常用方法，並不因為方法老舊而被淘汰 • 電穿孔(electroporation) 方式 • 瞬間電流增加細胞膜孔洞提高DNA轉型效率

細菌品系的選擇 • 製作勝任細胞必須要選用正處生長旺盛期的健康細菌 • 現在大量被用來作實驗的細菌大部分是大腸桿菌，僅品系不一樣strain • 防止細菌發生基因重組或突變

DNA重組成功的篩選方法-菌落藍白篩選 • 確認載體成功進入細菌 • 使用抗生素標記 • 確認基因有接入載體 • lacZ基因被插壞

乳糖操作組 半乳糖苷酶滲入酶乙醯基轉化酶無作用之抑制劑誘導物 (Klein et al.2003)

確定DNA重組成功的方法 • LacZ基因可產生半乳糖苷酶，分解X-gal生成藍色菌落 • LacZ基因被外來DNA插壞，不產生半乳糖苷酶，無法分解X-gal，菌落呈白色

半乳糖苷酶 X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indoyl-β-D-galactopyranoside )

基因庫的建立與篩選 原核生物：染色體DNA 真核生物： mRNA ↓ cDNA ↓ 質體株(plasmid clones) ↓ 基因體庫(genomic library) ↓ 專一性分子探針(molecular probe)

mRNA的純化步驟

cDNA製作

基因庫中的序列片段為隨機，需要多少DNA片段才能涵蓋整個基因組？基因庫中的序列片段為隨機，需要多少DNA片段才能涵蓋整個基因組？ • 篩到基因的機率(細菌) 公式：N = ln (1 -P) / ln (1 –F/T) • N 所需篩選的重組clone數目 • P 篩到基因的期望值 (0.99) • F 單一個重組DNA的平均片段大小 (5 kb) • T 基因組大小 (460萬 bp ＝ 4600 kb) N = ln (1-0.99) / ln (1 – 5/4600) = ln 0.01 / ln 0.998913 = -4.6 / - 0.0010879 = 4234

真核生物的基因組比較複雜，不適合上述公式的計算基礎真核生物的基因組比較複雜，不適合上述公式的計算基礎 • 基因組中具有exon, intro片段 • 所抽取當時細胞表達的基因之mRNA，所有基因的百分比 • mRNA反轉錄成cDNA的效率

分子選殖（ molecular cloning ）