Presentación de Seminario

1. Presentación de Seminario Integrantes: Elina Godoy - Eliana Tetamanzi

2. Oligosacáridos de Hialuronano inducen el clivaje de CD44 y promueven la migración de las células tumorales que lo expresan.

3. Matrizextracelular ·        Está producida y orientada por las células que engloba. ·        Desempeña un papel activo en la regulación del comportamiento de las células que entran en contacto con ella, afectando a su desarrollo, su migración, su proliferación, su forma y su función. ·        Las macromoléculas que la conforman son: 1)      glucosaminoglucanos (GAG) que generalmente se encuentran unidos a una proteína formando proteoglucanos. 2)      Proteínas fifrosas de características estructurales (colágeno y elastina), y proteínas adhesivas (fibronectina y laminina). ·        La degradación de los componentes de la ME está controlada por proteasas. ·        Existen receptores en las células para los componentes de la ME, llamados integrinas.

4. Qué es CD44? *      Es una molécula de adhesión celular distribuida ampliamente que actúa como receptor de superficie para componentes de la matriz extracelular ( por ej. El HA ) *      Participa en varios procesos como el rolling linfocítico y migración e invasión de células tumorales. *      Puede ser clivado proteolíticamente Dicho clivaje juega un rol importante en la migración de células tumorales. El clivaje puede ser inducido in vitro( por ej. Por estherforbol o anticuerpos anti – CD44 ) ¨     No se conoce el inductor fisiológico del clivaje. El CD44 es clivado en el dominio extracelular por metaloproteasas ( MT1 – MMP )

5. ¿Qué es HA? * Es un glucosaminoglucano no sulfatado lineal. Se caracteriza por la repetición de unidades disacárida de ácido- d-glucurónico y N-acetil-D-glucosamina. -Tiene otras funciones además de ser un componente de la matriz extracelular: ¨     -Se ha observado un aumento en su síntesis en tumores malignos. ¨     -Aumenta la adhesión y migración de células tumorales. ¨     -Forma una barrera protectora en las células tumorales ( esto podría colaborar evadiendo el sistema inmune ) ¨     -A pesar de que HA puede encontrarse como polímero de alto peso molecular en la matriz extracelular bajo condiciones fisiológicas, se detecta con bajo peso molecular en asociación en condiciones patológicas como inflamaciones y tumores.

6. ¿Qué es HA? *Altos niveles de fragmentos angiogénicos de HA son detectados en tumores humanos tales como: ¨     -Cáncer de vejiga ¨     -Cáncer de Próstata ¨     -Tumores de Wilm ¨     -Mesotelioma *Alta actividad hialunoridasa se observa en: ¨     -Cáncer de vejiga ¨     -Cáncer de Próstata

7. Se Puede Deducir: *La degradación autorregulatoria de HA en tejidos tumorales aumentaría la invasión tumoral y la metástasis. *HA y/o sus productos de degradación podrían estar involucrados en el clivaje de CD44 que aumentan la motilidad tumoral.

8. Se Pretende Demostrar: Los oligosacáridos pequeños de HA (no los grandes ) inducen eficientemente el clivaje de CD44 y también promueven la migración de células tumorales a través de CD44

9. Resultados • Objetivo: Examinar la expresión de CD44 las células MIA Paca-2 • Panel de la izquierda: • línea completa con 10 g/ml de isotiocianato de fluoresceína • -línea punteada sin 10 g/ml de isotiocianato de fluoresceína • Ambos conjugados con BRIC235 (anti CD44 humano que se une al dominio extracelular).

10. Resultados         Objetivo: Analizar la habilidad de las MIA Paca-2 para unirse a HA- Panel central, línea completa: MIA Paca-2 con 1 g/ml de FL-HA - Panel central, línea punteada: MIA Paca-2 sin 1 g/ml de FL-HA (HA conjugado con fluoresceína)

11. Resultados • La unión de HA fue completamente afectada en presencia de BRIC235 ( Panel de la derecha, línea Punteada ) pero no fue afectada en presencia de IgG de ratón (Panel de la derecha, línea continua) que funcionó como control.

12. Resultados              Clivaje de CD44 –Técnica: Inmunoblotting: Las células fueron incubadas con (10 M MG132 (inhibe que el dominio extracelular se rompa) durante 30 mín. Luego se lo incuba con MPA por otros 30 mín y posteriormente fueron lisadas con SDS. Las muestras con igual cantidad de células fueron analizadas con anti CD44 citoplasmático o con anti--tubulinas. Sobrenadante- Analizado con ELISA. Muestra valor medio y SD obtenido a partir de tres experiencias independientes.

13. Conclusión Las MIA Paca-2 expresan activamente CD44 y aumenta el clivaje del mismo si se las trata con PMA.

14. Resultados HPLC – Se analizan fragmentos de HA. HA de 200kDa fue digerido con Hialuronidasa testicular de un carnero. Los fragmentos degradados poseen entre 6 y 14 monosacáridos.

15. Resultados B)    El cultivo celular fue tratado con MG132 (inhibe que el dominio extracelular se rompa) y luego con o sin PMA o con distintos fragmentos de HA. El análisis fue realizado por inmunoblotting. C)     Se utiliza para el inmuoblotting, Ha de 200kDa

16. Conclusión -         A mayor concentración de fragmentos de HA hay un aumento en el nivel de clivaje de CD44. -         Se observa que Ha de 200 kDa no produce clivaje de CD44, aunque se aumente la concentración del mismo.

17. Resultados En las figuras A) y B) se observan los HPLC de Ha con tratamiento de hialuronidasa (A) o hialuronidasa desnaturalizada (B)

18. Conclusión Los fragmentos de HA pierden su habilidad para inducir el clivaje de CD44 bajo digestión con hialuronidasa intacta pero no con hiauronidasa desnaturalizada El clivaje sería inducido por fragmentos de HA, pero no por disacáridos.

19. Resultados MIA Paca–2 tratadas con MG132 A)    En este caso las células son cultivadas confragmentos de HA de diferentes longitudes (máspequeños) B)    En este caso se cultivó con fragmentos de HA más grandes. C) Se observa el análisis densiométrico de bandas de 25 kDa observadas cuando las células MIA Paca-2 fueron tratadas con distintas preparaciones de Ha.

20. Conclusión El clivaje de CD44 es inducido por fragmentos de HA pequeños y no por fragmentos grandes

21. Resultados A)    Panel de la izquierda, línea continua: MIA Paca-2 incubadas con 10 g / ml FL- HA. (el FL-HA estuvo ausente en el cultivo representado por la línea punteada ) Panel de la derecha: Las Células fueron tratadas con 10 g / ml de BRIC235, previo a la incubación con FL-HA. No se observó adherencia de FL-HA en el gráfico de la derecha. B) Las células fueron incubadas con ( curva pintada) o sin diluciones seriadas de varias preparaciones de HA seguidas de incubación con FL-HA Las líneas punteadas corresponden con la fluorescencia de células cultivadas en medio únicamente.

22. Conclusión Los fragmentos de 6.9 kDa se unen a la superficie celular de CD44.

23. Resultados MIA Paca-2 incubadas con 10 M MG132. Anteriormente fueron tratadas con: línea 4: 10 g / ml de BRIC235 líneas 1 a 3: 10 g / ml de BRIC235 e incubados con PMA (línea 2 ) o con distintos frHA (líneas 3 y 4) Luego las células fueron lisadas con SDS y analizadas por inmunoblotting.

24. Conclusión El clivaje de CD44 inducido por fragmentos de HA, es bloqueado por anti-CD44 BRIC235

25. Resultados Células MIA Paca-2 sembrada a una concentración de 3*105 células e incubadas con fragmentos de HA de 1000 kDa toda a noche a 37ºC

26. Resultados A-B-C : Sin tratamiento posterior D-E-F : Incubadas con fragmentos de HA de 6.9 kDa G-H-I : Incubadas con fragmentos de HA de 1000 kDa J-K-L : Incubadas con PMA Luego de estimulación, las células fueron tratadas con: A-D-G-J: Anti CD44 citoplasmático B-E-H-K: Fragmentos de actina C-F-I-L: Representa la imágenes fusionadas.

27. Conclusión Los fragmentos de HA de 6.9 kDa inducen la formación de filopodios.

28. Resultados Se mide en este caso la migración celular en cada caso. Se observa la mayor migración en el tratamiento con fragmentos de HA de 6.9 kDa. No se observa mayor migración en la calle 5 debido a la presencia de BRIC235.

29. Discusión • El clivaje de CD44 se produce aparentemente por la interacción entre los pequeños fragmentos de HA de 6.9 kDa y el CD44. • El fragmento de 6.9 kDa de HA promueve la migración celular de tumores en forma dependiente de la presencia de CD44. • Las distintas medidas de fragmentos de HA tienen distintas funciones biológicas. • Se sostiene la hipótesis de que el oligosacárido pequeño actúa como inductor fisiológico de clivaje de CD44 en tejidos tumorales. • Parece ser esencial para el clivaje de CD44, que se adhiera HA. • EL PEQUEÑO OLIGOSACÁRIDO INDUCE EL CLIVAJE DE CD44, Y ESTO ES UN CONOCIMIENTO DE RELEVANCIA EN EL ESTUDIO DE LOS TUMORES. CIERTAMENTE, LOS TUMORES TIENEN ALTA ACTIVIDAD DE HIALURONIDASA, LA CUAL GENERA LOS FRAGMENTOS DE HA. • El HA de 6.9 kDa es un potente inductor del clivaje y La migración celular.