Seente geneetika II

1. Seente geneetika II Heidi Tamm 5. märts 2010

2. Suguline paljunemine • Seened mudelorganismidena • Tetraadide analüüs • Komplementatsiooni test • S. cerevisiae genoom • Proteoomika

3. Suguline paljunemine • Et saada maksimaalset kasu, peaksid ühinevate rakkude tuumad olema nii erinevad kui võimalik • Tsütoplasmad peaksid olema nii sarnased kui võimalik (et vältida geneetilist saastust) • Vegetatiivne vs. seksuaalne kokkusobivus

4. Isane või emane? • ei ole võimalik eristada • seened on hermafrodiitsed

5. Vegetatiivne kokkusobivus • Heterokaarüonid tekivad vaid samasse vegetatiivse kokkusobivuse gruppi kuuluvate hüüfide vahel • Kui hüüfid ei ole kokkusobivad, siis vahetult kontakteeruvad rakud surevad

6. Vegetatiivne kokkusobivus/sobimatus • Liitumise kokkusobimatus (fusion incompatibility) - kokkusobivussüsteem määrab ära rakkude võime liituda. (hallitusseentel) • Liitumisejärgne kokkusobimatus (post-fusion…) – määrab ära, kas rakud jäävad pärast liitumist ellu; kas koos tsütoplasmaga saavad migreeruda ka tuumad jm. organellid

7. Ristumissüsteemid • On määratud tuuma geenide poolt, mis takistavad kahe geneetiliselt identse mütseeli ristumist • Heterotallism – süsteem, kus on takistatud ristumine kahe identse gameedi vahel • Homotallism – kui miski ei takista identsete gameetide ristumist

8. Heterotallism • anastomoos on võimalik ainult kahe erineva talluse vahel • 90% kandseentest

9. Homotallism • suguline paljunemine saab toimuda ilma interaktsioonita kahe talluse vahel • iseviljastumine • primaarne vs. sekundaarne homotallism

10. Primaarne homotallism • idaneb ühetuumaline eos, moodustub kahetuumaline mütseel • tuumad on ühesugused • moodustuvad viljakehad

11. Sekundaarne homotallism • kui peale meioosi satub ühte eosesse 2 tuuma

12. Ristumissüsteemid: unifaktoriaalne • unifaktoriaalne ehk bipolaarne • ristumist kontrollib üks lookus kahe alleeliga • alleelide lahknemine meioosis tagab, et ühes eoses on vaid üks alleel. Edukalt ristuvad vaid rakud, millel on ristumistüübi lookuses erinevad alleelid.

13. Ristumissüsteemid: unifaktoriaalne • kui ühe viljakeha eostest kasvanud mütseele ristata omavahel, toimub dikaarüonide moodustumine 50% juhtudest • kottseened, ikkesseened • rooste- ja nõgiseened

14. Ristumissüsteemid: bifaktoriaalne • Kaks omaette ristumistüübi lookust (A ja B). • Bifaktoriaalne e. tetrapolaarne • Edukaks ristumiseks on vaja erinevaid alleele mõlemas lookuses

15. Ristumissüsteemid: bifaktoriaalne • Populatsioonis võib olla palju erinevaid alleele kummagi lookuse kohta • 55% kandseentel Kui ühe viljakeha eostest kasvanud mütseele ristata omavahel, toimub dikaarüonide moodustumine 25% juhtudest

16. Ristumisfaktorid: bifaktoriaalne • “A” geen kodeerib homeodomääni valke (transkriptsioonifaktoreid) • “B” geen kodeerib feromone ja nende retseptoreid • kummalgi geenil on alamlookused

17. S. cerevisiae ristumistüübi faktorid • 2 ristumistüüpi: a ja α • Ristumistüüp määratud: • peptiidhormoonide (feromonide) poolt (α- ja a-faktorid) • feromonispetsiifiliste retseptorite poolt

18. Kuidas ristumistüübi faktorid toimivad? • Feromon seostub vastastüüpi raku pinnal oleva retseptoriga. Selle sündmuse tagajärjed: • rakus algab aglutiniini tootmine, nii kleepuvad rakud kokku • mõlema raku kasv peatub G1 faasis • muutub rakuseina struktuur ja raku kuju

20. a-tüüpi rakkudes produtseeritakse: • a-feromoni • α-feromoni retseptorit • ja vastupidi

21. MAT lookus • Lookuses on 2 geeni (a1 ja a2 või α1 ja α2) • MATa1 represseerib a-feromoni retseptori ja α-feromoni sünteesi • MATa2 funktsioon teadmata • MATα1 aktiveerib a-feromoni retseptori ja α-feromoni sünteesi • MATα2 represseerib α-feromoni retseptori ja a-feromoni sünteesi

22. Kui tuumad on ühinenud: • Diploidid on alati MAT lookuse suhtes heterosügootsed • a1 ja α2 valgud moodustavad heterodimeeri, mis aktiveerib meioosi ja sporulatsiooni ja represseerib haploidsed funktsioonid

23. Et asi oleks tõeliselt segane... • Pärmi haploidsed rakud saavad oma ristumistüüpi muuta • Kontrollib geen HO (endonukleaas) • Dominantse alleeli korral toimub see peale igat raku jagunemist HML MAT HMR

24. (kott)seened mudelorganismidena • Saccharomyces cerevisiae • Aspergillus nidulans • Schizosaccharomyces pombe • Neurospora crassa

25. Saccharomyces cerevisiae kui mudelorganism • Eukarüoot • Lihtne kasvatada • Väike genoom kergestimanipuleeritav • Kasvab kiiresti • Mutantide isoleerimise lihtsus • Hästidefineeritud geneetiline süsteem • Rekombinatsioon kõrge sagedusega

26. Saccharomyces cerevisiae kui mudelorganism • Mitmekülgne DNA transformatsiooni süsteem • Nii haploidne kui ka diploidne faas stabiilne • Mittepatogeenne • Metaboolsed ja regulatoorsed mehhanismid kõrgelt konserveerunud • Inimeste haigustega seotud geenide ortoloogid • ...

27. Pärm: milliseid protsesse uuritakse? • Geeniregulatsioon • raku koostisosade biosüntees • mRNA translatsioon • valkude post-translatsiooniline modifitseerimine • valkude sekreteerimine • mitokondri biogenees • võõrgeenide ekspressioon

28. Pärm: mida uuritakse? • Rakutsükli regulatsioon • Signaaliülekande mehhanismid • Kromosoomi struktuur • DNA replikatsioon • Genoomika

29. Neurospora ja Aspergillus Haploidne vegetatiivne faas ja haploidsed koniidid - seeneniidistiku fenotüübi järgi saame teha järeldused genotüübi kohta

30. Neurospora

31. Aspergillus

32. Neurospora ja Aspergillus • Iga eoskott sisaldab 8 eost • peale meioosi toimub mitoos • 2n tuuma iga üksik DNA ahel läheb ühe eose tuuma • võimaldab algse DNA detailset analüüsi • isegi heterodupleksi erinevused tulevad välja (osaline erinevus kaksikheeliksi ahelates)

33. Magnaporthe grisea • Riisi närbumistõve tekitaja (rice blast fungus) • Genoomi suurus 40.3 Mb • 7 kromosoomi • 10% genoomist kordusjärjestused (> 200 bp) • retrotransposoonid • sagedane rekombinatsioon

34. Magnaporthe grisea apressor koniid

35. Magnaporthe grisea • rekombinatsioonide tõttu genoom muutlik • looduses paljuneb mittesuguliselt • genoomi muutlikkus on seenele kasulik: • peremehespetsiifilisuse muutumine kui kaotsi lähvad geenid, mis põhjustavad potentsiaalses peremehes kaitsereaktsioone

36. Seente transformatsioon • Katsetatud paljudel seentel • Head protokollid olemas üksikute jaoks: • Saccharomyces • Aspergillus • Neurospora • Ustilago

37. Võimalused transformatsiooniks • Protoplast • Terve raku töötlemine Ca2+ ja Li+ ioonidega • Elektroporatsioon • Geenipüss (gene gun, particle bombardment)

38. Mida on vaja transformatsiooni läbiviimiseks? • Vektor, milles meid huvitaval geenil on sobiv promootor ja terminaator • Seenerakud peavad olema kompetentsed • Selektsioonisüsteem • (Protoplastidest tuleb regenereerida mütseel)

39. N. crassa – tetraadide analüüs • Eoskotid kui korrastatud tetraadid - alleelide kombinatsioon eostes vastab meioosi I ja II jagunemisele • meioos I - kahe (homoloogilise) kromosoomi lahknemine • meioos II - kahe tütarkromatiidi lahknemine

40. Tetraadide analüüs • Saab jälgida rekombinatsiooni toimumist ja kindlaks teha aheldatuse gruppe • Kottseened sobivad geenide meiootiliseks kaardistamiseks • Pärmil on eoskotis 4 eost, mis on ühe meioosi tulemus • Mitme alleeliga geenide aheldus • Lookuse asukoht tsentromeeri suhtes

41. Tetraadide analüüs tänapäeval • Et kindlaks teha mutatsiooni, mis vastab konkreetse lookuse muutmisele • Et konstrueerida uusi tüvesid • Et kindlaks teha geenide interaktsioone

42. Erinevad tetraaditüübid. Ristati AB × ab Eri tüüpide osakaal näitab, kas A ja B on aheldunud

43. Auksotroofid • Auksotroofsed mutandid, kes pole ühe geeni muteerumise tõttu võimelised kasvama teatud söötmel • Kasv taastub, kui söötmele lisada vajalik komponent Esineb spetsiifiline sõltuvus konkreetse geeni produkti ja metaboolse sammu vahel. “Üks geen - üks valk” hüpotees

44. Auksotroofne organism sisaldab mutatsiooni, mis muudab organismi toitumisvajadusi • Prototroof – metsiktüüpi organism muutmata toitumisvajadustega

45. Pärmi auksotroofsed markerid • Aminohapped • Leu • His • Trp • Nukleotiidid • Uratsiil • Adeniin Selektsioonivahend molek. geneetiliste katsete puhul

46. Mis on komplementatsioon? • Kahe auksotroofi ristamisel saadud diploid on prototroof, kui defektid on erinevates lookustes • Alleel, mis ühes haploidis on mutantne (retsessiivne), on teises haploidis funktsionaalne (dominantne) • Mõlema haploidi wt alleelid kompenseerivad teise haploidi defektse alleeli

47. Mis on komplementatsioon? • Kui defektid on samades lookustes, siis kahe auksotroofi ristamisel tekkiv diploid on auksotroof • Retsessiivne homosügoot • Ka eri liikidelt pärit geenid võivad üksteist täiendada

48. Komplementatsiooni test • Haploidsete auksotroofide genotüüpide kindlakstegemiseks • Tundmatu genotüübiga haploid ristatakse teadaolevate genotüüpidega haploididega • peavad olema erineva ristumistüübiga

49. Komplementatsioonigrupid • Kui defektsete tüvede ristamisel ei toimu komplementatsiooni, kuuluvad nad samasse gruppi • Iga grupp esindab ühte ensüümi biokeemilises rajas • Suuremahulised projektid võimaldavad identifitseerida kõik kompl. grupid => kõik geenid metaboolses rajas Geeni defineerimine toime järgi

50. Alati pole kõik nii ilus… • Kahe lookuse suhtes heterosügootne diploid võib fenotüübilt olla ikkagi defektne • Alleelne ehk geenisisene komplementatsioon – mutatsioonid on mõlemas tüves samas lookuses