Media Type

1. YT

2. Composition Buffer (phosphate based) Nitrogen source (ammonium chloride or ammonium sulfate) Carbon Source (glucose or glycerol) Trace Metals (Ca, Co, Cu, Fe, Mn, Mo, Se and Zn) Vitamins (Biotin, thiamine, folic acid, riboflavin, niacinamide, PABA, pantothenic acid and pyridoxine) Composition Tryptone Yeast extract Sodium Chloride Examples Luria Broth (LB) 2xYT TB (phosphate buffered) Media Type Chemically Defined Rich Media

3. 1xM9 salts 2mM MgSO4 0.1mM CaCl2 0.4% carbon source (e.g. glycerol, glucose, etc.) 1g nitrogen source (15N) In sterile H2O 5X M9 salts contains: 64 g Na2HPO4.7H2O 15 g KH2PO4 2.5 g NaCl 5 g NH4Cl dissolved in deionized water to a final volume of 1 L M9 minimal medium M9 medium is a minimal growth medium used for bacterial cultures. It has the advantage of being cheap • Isotopically labeled proteins can be prepared straightforwardly in E. coli by growing cells in minimal media M9 supplemented with appropriate nutrients (15NH4Cl, 13C-glucose) • For large proteins deuterium labeling provides simplified spectra • for the remaining 1H nuclei and has useful effects on relaxation • properties of attached or adjacent atoms (1H, 15N,13C).

4. pET expression of At3g17210 pQE expression of At3g17210 Rich vs. Minimal Media

5. Parametri delle colture

7. Temperatura Da 16°C a 37°C Surf1 pTH24 C41 25° Surf1 pTH24 C41 18° M IB IB Prot FT1 FT2 W1 W2 W3 W4 W5 E1 E2 E3 M IB Prot FT1 FT2 W1 W2 W3 W4 W5 E1 E2 E3

9. IPTG • Differenti concentrazioni • 1mM - 0.1mM • Induzioni a tempi diversi

10. plateau Unità formanti colonie morte esponenziale latenza t FASE DI LATENZA: intervallo di tempo in cui i microrganismi si adattano all’ambiente (non si moltiplicano) FASE ESPONENZIALE: periodo di tempo in cui i microrganismi si moltiplicano in modo progressivo e costante PLATEAU: si stabilisce un equilibrio tra il numero delle cellule che si moltiplicano e il numero di cellule che muoiono FASE DELLA MORTE: cessa la moltiplicazione dei microrganismi che invecchiano e muoiono

11. Trasformazione del DNA per espressione proteica Trasformazione in BL21 A 100.0 l di cellule competenti di E. coli (BL21) si aggiungono X l (corrispondenti a 100 ng) di uno dei campioni di DNA plasmidico che hanno dato risultato positivo allo screening. Controllo: in parallelo compiere la stessa reazione aggiungendo X l di acqua sterile invece del plasmide. 30’, ghiaccio 90’’, 42°C 2’, ghiaccio aggiungere 900.0 l 2xYT, 1h shaker a 37°C, 150 rpm. Strisciare su piastre contenenti 2xYT + amp (200 g/ml), 200.0 l di ognuna delle trasformazioni. O/N, 37°C

12. Coltura massiva Abs600 raccolta cellule +IPTG fase esponenziale 0 4 8 12 16  Inoculo Si prelevano singole colonie che vengono trasferite in alcuni ml di terreno liquido. Si lascia incubare in shaker alla temp. opportuna per il ceppo batterico, per circa 12-16 ore (fase stazionaria)  Coltura massiva L’inoculo viene trasferito in alcuni litri di terreno liquido, 1% in volume . Si lascia incubare in shaker alla temp. opportuna. All’inizio della fase esponenziale l’espressione della proteina viene indotta per aggiunta di un induttore che determina l’avvio della trascrizione proteica tempo di incubazione IPTG

13. Procedura per l’espressione di rame proteina Preparazione inoculo da piastra Inoculare 2 tubi contenenti ciascuno 6 ml di 2xYT + amp (200 g/ml) con 2-3 colonie prelevata da piastra. Mettere ad incubare in shaker O/N a 37°C. Preparazione coltura massiva Inoculare 2 beute da 2l contenenti ciascuna 0.5 l 2xYT + amp (200 g/ml) con 5 ml di inoculo già preparato. Mettere ad incubare in shaker a 37°C. Misurare ad intervalli regolari la densità ottica a 600 nm. Quando la densità ottica raggiunge il valore di 0.6, aggiungere a ciascuna beuta 1.0 ml di soluzione di IPTG 0.5 M (concentrazione finale 1 mM) e 125 l di soluzione di CuSO4 1 M Continuare l’incubazione in shaker alla temperatura di 25°C per 16 h. Aggiungere 375 l di soluzione di CuSO4 1 M 45’ prima di raccogliere le cellule Isolamento della proteina Rottura delle cellule Separazione dell’estratto dalle cellule

18. Ottimizzazione per lo scale-up

19. Minifors fermenters • Interactive control of culture parameters: Temp, pH, pO2 • Parameters can be automatically changed during the culture from a computer • Possibility of feed/continuous cultures

20. GESTIONE DEI PARAMETRI DI PROCESSO

22. Nei processi di estrazione e purificazione delle proteine, a differenza di quanto avviene per il DNA/cellule, non occorre prestare attenzione alla sterilità ma bisogna evitare la denaturazione dei campioni (elevate temperature, detergenti, valori estremi di pH possono denaturare facilmente le proteine) Inoltre è importate procedere all’estrazione delle proteine il più velocemente possibile, per evitare processi degradativi. Per conservare i campioni da cui estrarre le proteine vanno congelati rapidamente in azoto liquido (-140°C) e poi conservati in frigo a -80°C

23. ESTRAZIONE______________________________________________ LISI DELLE CELLULE  Localizzazione della proteina  Tipo di cellule  Quantità di cellule BUFFER DI LISI  Localizzazione della proteina  Parametri chimico-fisici della proteina (pI, idrofobicità, …)  Presenza di Cys ridotte/ossidate  Metalli  Regioni transmembrana  Attività proteolitica  Rimozione di acidi nucleici CHIARIFICAZIONE  Centrifugazione  Ultrafiltrazione

24. Proteine extracellulari secrete nel terreno di cultura o nel siero possono essere rimosse dal materiale insolubile per semplice centrifugazione Proteine intracellulari possono essere recuperate dopo rottura delle cellule La procedura adottate per ottenere un estratto grezzo (estratto contenente tutte le proteine cellulari solubili nel tampone di estrazione utilizzato) dipende dalla localizzazione cellulare della proteina di interesse.

26. I metodi utilizzati per la rottura delle cellule dipendono in gran parte dalla fragilità delle cellule Cellule animali -Cellule fragili (eritrociti) -Cellule che contengono materiale fibroso (c. muscolari) Cellule vegetali Più difficili da rompere perché contengono cellulosa • Microorganismi • Batteri che si lisano facilmente • Batteri con pareti più resistenti

27. Utilizzo di detergenti per dissolvere • la membrana cellulare

28. Proteine di secrezione  Le proteine contengono segnali che ne determinano la destinazione. Una proteina può restare nel citosol, può essere portata sulle membrane plasmatica o interna, nello spazio intermembrana o nel mezzo intracellulare.  Sequenze segnale aminoterminali (16-26 AA) dirigono le proteine batteriche attraverso le membrane plasmatiche od esterne del batterio. Vengono riconosciute e tagliate da opportune peptidasi  Proteine secrete nel periplasma possono essere recuperate per rottura della sola membrana esterna (shock osmotico)

29. Shock osmotico Per 1 litro di coltura  Centrifugare la cultura a 8000 rpm per 10’, 4°C.  Disperdere il pellet in 50 ml Tris-HCl 10 mM a pH 7.5. Aggiungere 50 ml di soluzione di saccarosio al 40% in 10 mM Tris-HCl pH 7.5 + 2 ml di soluzione EDTA 0.5 mM pH 8. Le soluzioni devono essere ice-cold. Tenere in agitazione in ghiaccio in camera fredda per 20’.  Centrifugare 10000 rpm per 15’ a 4°C. Rimuovere accuratamente il surnatante.  Disperdere il pellet in 30 ml H2O fredda tenere in bagno di ghiaccio per 20’. Centrifugare per 15000 rpm per 15‘ a 4°C. Raccogliere accuratamente il surnatante che contiene la proteina.  Disperdere nuovamente il pellet in 20 ml H2O fredda e tenere ancora per 20’ in bagno di ghiaccio sotto agitazione.  Centrifugare a 15000 rpm per 15’ a 4°C e raccogliere il surnatante. Riunire i due surnatanti.

31. LISI DELLE CELLULE

32. Tecniche di rottura delle cellule

33. Uso del lisozima nella rottura della parete cellulare Il lisozima lisa alcuni tipi di batteri rompendo la componente polisaccaridica della parete, formata da 2 tipi di zuccheri, N-acetilglucosamina (NAM) e da acido N-acetilmuranico (NAG). La parete perde rigidita’ e il batterio scoppia a causa dell’elevata pressione osmotica intracellulare Il lisozima idrolizza il legame glicosidico tra il C-1 del NAM e il C-4 del NAG

34. Alcuni sistemi per rompere le cellule

35. Vari modelli di omogeneizzatore.

40. SCELTA DEL BUFFER DI LISI I buffer più utilizzati sono: Fosfato – Tris – HEPES (pH: 5.8-9) Concentrazioni del buffer: 20-50 mM Tris: il pH dipende dalla temperatura pKa: 8.06 a 25°C 8.85 a 0°C

41. SCELTA DEL BUFFER DI LISI

42. TAMPONI COMMERCIALI

44. SCELTA DEL BUFFER DI LISI ADDITIVI:  Aumentano la stabilità della proteina  Aumentano la solubilità della proteina

47. - 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate - Molecular Weight: 614.88g - Micelle Molecular Weight: 6149g - Critical Micelle Concentration (CMC): 8 to 10mM - Dialyzable: Yes