Metoda ekspresji i oczyszczania białka eIF4E jako białka fuzyjnego z reduktazą dihydrofolianową

1. Metoda ekspresji i oczyszczania białka eIF4E jako białka fuzyjnego z reduktazą dihydrofolianową Gosh P.,Cheng J., Chou T,Jia Y., Avdulov S., Bitterman P.B., Polunovsky V.A., Wagner C.R. „Expression, purification and characterization of recombinant mouse translation initiation factoe eIF4E as a dihydrofolate reductase (DHFR) fusion protein” Protein Expression and Purification 60 (2008) 132-139 Dorota Kubacka

2. Funkcje eukariotycznego czynnika translacyjnego 4E – eIF4E eksport wybranych mRNA z jądra do cytoplazmy inicjacja translacji zależnej od kapu inicjacja translacji wielu wirusowych VPg-mRNA Goodfellow at al., (2008) Int J Biochem Cell Biol 40, 2675-80

3. Mechanizmy regulacji inicjacji translacji Sonenberg at al., (2009) Cell 136, 731-745

4. negatywne zmiany ilości i aktywności • inicjacyjnych czynników translacyjnych, regulatorowych czynników translacji, tRNA … proces starzenia się nieprawidłowy rozwój organizmu zmiany chorobotwórcze (nowotworowe) mechanizm uczenia się i pamięci Obszary badań związane z regulacją inicjacji translacji mRNA • poznanie mechanizmów regulacyjnych inicjacji translacji

5. Peptydy i białka pełniące rolę etykietek

6. Zalety i wady etykietek • Zalety: • ułatwiają oczyszczenie rekombinowanych białek • zwiększają wydajność ekspresji białka (np.: GST, MBP, NusA, Ubiquitin) • ułatwiają zwijanie się białka( np.: SUMO) • zwiększają rozpuszczalność białka( np.: MBP, NusA, SET) • wysoka specyficzność do ligandu • niskie koszty złoża (np.: GST, MBP, His6) • … • Wady: • powodują zmianę konformacji białka • obniżają wydajność ekspresji białka • wysokie koszty złoża • …

7. Enzymy stosowane w procesie usuwania etykietek

8. Metody ekspersji i oczyszczania białka eIF4E • oczyszczanie obecnego w supernatancie eIF4E na kolumnie m7GDP-agarose/m7GTP-Sepharose • elucja: m7GTP lub wysokim stężeniem soli • wydajność: do 2.5 mg z 1L kultur bakterii • indukcja prowadzona w 15ºC – 7-10 mg z 1L kultur bakterii • oczyszczanie nierozpuszczalnej frakcji białka eIF4E • denaturacja w 6 M GdnHCl • renaturacja w procesie 1 stopniowej dializy • wydajność: 100 – 200 mg z 1L kultur bakterii • oczyszczanie GST-eIF4E • denaturacja w 6 M GdnHCl • renaturacja poprzez 20 krotne szybkie rozcieńczenie frakcji zdenaturowanej • oczyszczanie GST-eIF4E na kolumnie z glutathion-Sepharose • wydajność: 200 –500 mg z 1L kultur bakterii

9. Fuzyjne białko DHFR-eIF4E Cel pracy: uzyskanie czystego, w pełni funkcjonalnego, wolnego od kapu białka eIF4E Ghosh at al., (2008) Protein Expr. Purif. 60, 132-139

10. DHFR – reduktaza dihydrofolianowa • 18 kDa białko • przeprowadza reakcje redukcji kwasu dihydrofoliowego do kwasu • tetrahydrofoliowego

11. pellet SN MW - + + IPTG DHFR(L54F)-eIF4E Ekspresja białka DHFR(L54F)-eIF4E • gospodarz: E. Coli BL21(DE3) plac I Tuner • 3.5h indukcja 0.2 mM IPTG w 37°C • przy OD600= 0.4 Ghosh at al., (2008) Protein Expr. Purif. 60, 132-139

12. Metotreksat – jeden z inhibitorów reduktazy dihydrofolianowej DHFR – reduktaza dihydrofolianowa Metotreksat • inhibitor DHFR, hamuje syntezę kwasów nukleinowych • wiąże się z DHFR 10 tys. razy silniej niż kwas foliowy • stosowany jako lek min. w chorobach nowotworowych

13. Oczyszczanie białka DHFR-eIF4E na kolumnie MTX-agarose Wiązanie białka do kolumny : pH 6.0 Warunki elucji DHFR-eIF4E: 10 mM KH2PO4, 0.1 mM K2EDTA, 1 M KCl, 1 mM DTT, pH 9.0, 3 mM kwas foliowy Ghosh at al., (2008) Protein Expr. Purif. 60, 132-139

14. Oczyszczanie białka eIF4E • oczyszczanie DHFR-eIF4E na kolumnie DEAE • dializa DHFR-eIF4E do buforu aktywności enzymatycznej dla Trombiny: • 50 mM Tris, pH 8.0, 0.1 M NaCl, 2.5 mM CaCl2 • proces cięcia sekwencji białkowej linkera przez Trombinę w ciagu 20h, 4 °C • oczyszczanie eIF4E na kolumnie jonowymiennej DEAE Elucja prowadzona gradientem soli 0 - 0.4 M KCl w buforze: 20 mM Tris, 1mM EDTA, 1 mM DTT, pH 7.4 Wydajność: ~2.5 mg białka eIF4E z 2L hodowli Ghosh at al., (2008) Protein Expr. Purif. 60, 132-139

15. Aktywność białka eIF4E i DHFR-eIF4E FE – intensywność florescencji białka bez kapu FEL – intensyność fluorescencji białka z kapem ET – całkowite stężenie enzymu LT – całkowite stężenie ligandu KD – stała dysocjacji wiązania białko-kap Warunki pomiaru: 50 mM Hepes pH 7.2, 100 mM KCl, 1mM DTT, 0.5 mM Na2EDTA, T = 22 °C, λwzb = 280 nm, λobs = 342 nm

16. Aktywność rekombinowanego białka eIF4E i DHFR-eIF4E w inicjacji translacji • translacja in vitro mRNA lucyferazy Renilla w lizacie z retikulocytów króliczych Ghosh at al., (2008) Protein Expr. Purif. 60, 132-139

17. Zalety i wady opracowanego systemu ekpsresyjnego • zalety • oczyszczanie fuzyjnego białka DHFR(L54F)-eIF4E na kolumnie • MTX-agarose • złoże jest stabilne, • wysoka pojemność złoża ~80 mg/ml • wysoka selektywność metotreksatu (MTX) • niskie koszty • zależność wiązania białka DHFR(L54F) z metotreksatem od pH; • wiązanie – pH = 6.0, elucja – pH ~ 9 • brak kontaktu z kapem • białko nie jest renaturowane • białko meIF4E zachowuje swoja aktywność • wady • docelowe białko może być niestabilne w wybranych warunkach pH

18. Zastosowanie eDHFR-eIF4E w żywych komórkach reduktaza dichyrofolianowa z E. coli • TMP – trimetoprim – syntetyczny inhibitor bakteryjnej reduktazy dihydrofolianowej • TMP wykazuje wysoką specyficzność do eDHFR w porównaniu ze ssaczym białkiem • DHFR • funkcje taga pełnią fluorescencyjne pochodne trimetoprimu Miller at al., (2005) Nature Methods 2 (4), 255-257

19. Fluorescencyjne pochodne trimetoprimu TMP_fluoresceina TMP_hexachlorofluoresceina Calloway at al., (2007) ChemBioChem 8, 767-774

20. Selektywne znakowanie w żywych komórkach • Linia komórek U2OS (human osteosarcoma cell) • znakowanie białkiem GFP zlokalizowanym jądrowo • znakowanie białkiem eDHFR : TMP_hexachlorofluoresceina zlokalizowanym • w błonie komórkowej Calloway at al., (2007) ChemBioChem 8, 767-774