4.lekcija BAROTŅU PIEDEVAS AUGU AUDU KULTŪRĀS

1. 4.lekcija BAROTŅU PIEDEVAS AUGU AUDU KULTŪRĀS

2. Aktīvā ogleAktīvā ogle (AO) bieži sekmē in vitro augšanu un organoģenēzi augu audiem, adsorbējot barotnē elementus un/vai no “konteinera” atmosfēras. Ph.Druart un O. De Wulf (1993) konstatē, ka saharozes hidrolīze, kas normāli sasniedz 10% autoklāvēšanas laikā, palielinājās līdz 95%, ja pievienoja 1% AO. Tas izraisa šķīduma paskābināšanos fruktozes veidošanās specifiskās reakcijas laikā. Rezultātā mainās C avots no sākotnējās saharozes līdz fruktozes, glikozes un saharozes maisījumam, kas jau ir par iemeslu osmolaritātes pieaugumam, agara želēšanas samazinājumam. Barotnē, kur pievienota aktīvā ogle, jāparedz lielāka agara koncentrācija nekā parasti (8-10 g/l).

3. Vitamīni Primārā vitamīnu funkcija praktiski bez izņēmuma ir to izmantošana kofermentu struktūrelementos (E.Libbert, 1976). Jo intensīvāka ir augu vielu maiņa, jo vairāk izmanto vitamīnus. Sevišķi tas attiecas uz embrionāliem audiem, kur noris protoplazmas augšana. Šai sakarībā autors min terminu “bioloģiski aktīvās vielas protoplazmas augšanai”.

4. Ļoti izteikta auksotrofija heterotrofiem augiem ir izolēto orgānu kultūrās. Piemēram, tiamīns(vitamīns B1), piridoksīns (vitamīns B6), nikotīnskābe (vitamīns PP) un pantotēnskābe tiek transportētas pa floēmu uz saknēm, pie tam saknes ir pilnīgi auksotrofas attiecībā pret tiamīnu, bet pret pārējiem – daļēji auksotrofas. Visbiežāk barotnēs pievieno B1, B6 un PP vitamīnus, sevišķi B1. Šie vitamīni optimizē auksīnu darbību audos, kas var būt nozīmīgi sekmīgai kultūras attīstībai.

5. Tiamīna hlorīdsTiamīns ir dekarboksilāzes un transketolāzes sastāvā. Tiamīna sintēze noris lapās, pie tam daudziem augiem tad ir vajadzīga gaisma. Tabakas serdes audu kultūrās tā sintēze notiek tikai citokinīnu klātbūtnē.Piridoksīna hlorīdsPiridoksīns piridoksālfosfāta formā ir kofermenta transamināzes u.c. aminoskābju vielu maiņas fermentu sastāvā.

6. NikotīnskābeNikotīnskābe ir viena no NAD un NADF sastāvdaļām.Šos trīs vitamīnus parasti lieto 0,1-5,0 mg.L-1 koncentrācijās barotnē.Mioinozīts (mezoinozīts, i-inozitols)Tas ir fitīna un daudzu lipīdu sastāvā. Mezoinozīts audu kultūrās darbojas ne tikai kā regulators – vitamīns, bet arī kā C avots. Tas lietojams salīdzinoši lielās devās – ap 100 mg.L-1.

7. FitohormoniAuksīniAuksīnus atklāja 21.gs. pirmajā pusē dāņu augu fiziologs F.W.Went. Augos endogēni sastopamais auksīns ir –indoliletiķskābe (IES). Īsi pēc tam konstatēja tās sakņu inducējošo darbību. Tika sintezēti tādi savienojumi kā -naftiletiķskābe (NES) un–indolilsviestskābe (ISS) ar auksīna tipa iedarbību.

8. Auksīnu lomu augā atklāja Skoog un Miller 1957. gadā. Viņi konstatēja, ka no izolētiem tabakas stublāja serdes audiem var iegūt in vitro dzinumu, ja ir relatīvi augsta citokinīnu, bet zema auksīnu koncentrācija barotnē; bet ja barotnē bija relatīvi augsta auksīnu, bet zema citokinīnu koncentrācija, tad veidojās saknes. Kad abu fitohormonu grupu vielas bija līdzsvarā, tad konkrētajā gadījumā veidojās kalluss (t.i., rētaudi).

9. Dažus gadus vēlāk izdevās iniciēt somatisko embriju veidošanos audu kultūrās, pielietojot 2,4-dihlorofenoksietiķskābi (2,4-D). Tagad par dabiskiem auksīniem, t.i., tādiem, ko spēj sintezēt paši augi, uzskata IES, ISS, feniletiķskābi (FES) un to konjugātus. Ir arī pētnieki, kas uzskata, ka tas vēl nav pietiekoši pierādīts.

10. Ir sintezēti vairāki ķīmiskie analogi, kas pagaidām nav atrasti augu audos. Tos mēs dēvējam par sintētiskiem auksīniem. Biežāk lietotie no tiem ir NES, 2,4-D, 2,4,5-trihlorofenoksietiķskābe (2,4,5-T), 3,6-dihloro-2-metoksibenzoskābe (dikamba) un p-hlorofenoksietiķskābe (angliski – 4-CPA).

11. Auksīni veidojas dzinumu galotnēs un tiek transportēti bazipetāli, t.i., no augšas uz leju, uz saknēm. Auksīniem piedēvē nozīmi šūnu stiepšanās stimulēšanā, primāro vadaudu indukcijā, novecošanās procesos, augļu attīstībā u.c. Bet kā galveno auksīnu funkciju, kādēļ tos pievieno barotnei, jāmin adventīvo sakņu veidošanās iniciācija.

12. Taču jāpiezīmē, ka auksīnu stimulējošā ietekme attiecas tikai uz sakņu veidošanās (atsevišķos gadījumos arī somatiskās embrioģenēzes iniciācijas) iniciālo fāzi. Tālāk to efekts kļūst inhibējošs, jo tie bloķē šo jaunveidojušos orgānu tālāku attīstību. Parasti auksīnus pieskaita stimulatoriem, bet šis iedalījums ir nosacīts, jo to darbība nav viennozīmīga, otrkārt, svarīga ir arī koncentrācija gan pašā augā, gan barotnē. Kā endogēnie, tā eksogēnie auksīni inhibē aksilāro pumpuru izaugšanu.

13. 2,4-dihlorfenoksietiķskābe (2,4-D). To parasti pievieno barotnei nolūkā iegūt vai nu kallusu vai somatiskos embrijus.Var rasties jautājums, kāpēc 2,4-D ir īpaša embriogēna daba? Tas ir herbicīds un īpašs stresa faktors. Nav izslēgts, ka somatiskā embrioģenēze ir galējā stresa izpausme un augu šūnu izdzīvošanas stratēģija in vitro, kas balstās uz šūnu totipotenci.

14. –indoliletiķskābe (IES). IES barotnē ātri sadalās, jo ir gaismas- un termonestabila. Toties tas ir dabīgais endogēnais auksīns, kam augā ir sava receptorā platforma, un audi to salīdzinoši ātri uzņem.Augsts riboflavīna saturs vakuolās akumulē lielu daudzumu brīvo IES. Riboflavīns kontrolē IES metabolismu un tādā veidā var modulēt auksīn-atkarīgus procesus, t.sk. embrioģenēzi. Resp., auksīns + stress kopā rada gēnos izmaiņas, kas noved pie somatiskās embrioģenēzes.

15. -naftiletiķskābe (NES). NES ir salīdzinoši spēcīgākās iedarbības auksīns, ko augs uzņem relatīvi lēni; ir visumā termoizturīgs. F.Rossi un līdzautoru eksperimentu rezultāti (1993) ir parādījuši, ka barotne ar NES inducēja sakņu veidošanos plūmju potcelmos in vitro pēc tam, kad dzinumus ilgstoši turēja tumsā. Apgaismošana ar sarkano gaismu bijusi tikpat efektīva kā 0.5 mol.L-1 NES deva barotnē.–indolilsviestskābe (ISS). ISS ir ar nedaudz vājāku iedarbību kā NES, bet arī tas ir nosacīti, jo dažādi taksoni reaģē atšķirīgi.

16. Auksīni augā tiek uzņemti ātri, un tas notiek ar pārnesēja palīdzību. Šūnapvalka pH ir ~ 5,5IES – 4,7,Citoplazmai - pH ~ 7.Citoplazmā auksīni ir pārsvarā anjonu formā un tādā veidā tie tik viegli nevar tikt cauri plazmalemmai. Ārā auksīni tiek transportēti ar pārnesēju palīdzību. Tā kā šie pārnesēji atrodas šūnas bazālajā daļā, tad auksīns arī tiek transportēts virzienā uz saknēm. Auksīna transports noris ~ 1 cm.h-1.

17. Ātra IES uzņemšana iztukšo barotni. Ja audu kultūras audzē šķidrā barotnē, tad lielākais auksīna daudzums tiek uzņemts no barotnes dažās dienās. Auksīna iztukšošana no cietās barotnes beidzas drīz pēc subkultivēšanas, jo pieplūdums no citas barotnes daļas ir ļoti lēns. No visiem svarīgākajiem barotnes komponentiem auksīns ir vienīgais, ko var tik ātri iztukšot.

18. Augu audi var inaktivēt auksīnus, tos konjugējot vai fermentatīvi oksidējot. Kaut arī konjugēšana ir atgriezeniska un brīvā, aktīvā forma var tikt atbrīvota. Ir pierādīts, ka augos eksistē līdzsvars starp brīvajām un konjugētajām formām. Eksperimentāli dati rāda, ka 2,4-D konjugējas lēnāk nekā IES, ISS vai NES. IES tiek ātri oksidēta augu audos, īpaši ievainotos audos. ISS oksidējas, bet tas notiek lēni.

19. Rezumē I (pamatiedarbība uz audu kultūrām): • Adventīvo sakņu veidošanās iniciācija (augstās konc.). • Adventīvo dzinumu veidošanās iniciācija (zemās konc.). • Somatisko embriju veidošanās iniciācija. • Šūnu dalīšanās. • Kallusa veidošanās un augšana. • Sānu pumpuru augšanas inhibēšana. • Sakņu augšanas inhibēšana.

20. Rezumē II (metabolisms, iedarbība, transports): • 2,3,4,-trijodbenzoskābe (TIBA) un 1-N-naftilftalamic-skābe inhibē polāro auksīna transportu. • p-Hlorofenoksisviestskābe, kas pēc savas darbības ir antiauksīns, inhibē auksīna darbību, saistot auksīna receptoro platformu. • Fenola savienojumi (ferulskābe, floroglucīns) inhibē auksīna oksidēšanos. • Riboflavīns ievērojami veicina ISS un IES fotooksidēšanos.

21. GiberelīniPagaidām konstatēti ap 90 giberelīni. Tie veicina ziedēšanu, pārtrauc sēklu, pumpuru, sīpolu un bumbuļu miera periodu, veicina barības vielu patēriņu no sēklām un iniciē stumbra stiepšanos garumā.

22. Fitohormoni nesintezējas to darbības vietās. Miežu sēklu dīgšanas laikā giberelīni sintezējas un tad atbrīvojas (difundē) no embrija, pārvietojoties uz aleironu slāni, kur tie inducē hidrolītisko fermentu sintēzi un sekrēciju. Šie fermenti veido mazus fragmentus no makromolekulu rezervēm, kuri tad tiek izmantoti embrija iniciālā augšanā.

23. Giberelīni veidojas ujauno lapu plastīdās, ujaunās sēklās, uaugļos un usakņu galotnēs. Dzinuma galotnēs tie neveidojas.Transports akropetāli un bazipetāli.Gatavojot koncentrātus, jāatceras, ka tie šķīst 50 % etanolā.

24. Audu kultūrās giberelīnus lieto salīdzinoši reti. Parasti pievieno giberelskābi (G3), lai sekmētu dzinumu stiepšanos garumā. Pievienojamās koncentrācijas lielākoties ir no 0.1-3.0 mg.L-1. Atsevišķos gadījumos lieto arī giberelīnus G1, G4 un G7.

25. Giberelīnu sintēzi inhibē tādi savienojumi kā paklobutrazols, tetciklāze un ancimidols. Šie inhibitori audu kultūrās tiek lietoti biežāk nekā giberelīni, jo tieveicina sīpolu, bumbuļu veidošanos un var iniciēt embrioģenēzi, paaugstināt sakņu veidošanās spēju dzinumiem, kavēt stumbra stiepšanos garumā un paātrināt aklimatizāciju. Ir atzīmēts, ka daži giberelīnu sintēzes inhibitori bloķē ABS sintēzi.

26. Rezumē I (pamatiedarbība uz audu kultūrām): • Dzinumu stiepšanās garumā. • Sēklu, somatisko embriju, apikālo pumpuru un sīpolu miera perioda pārtraukšana. • Sānsakņu veidošanās inhibēšana. • Sintēzes inhibitori veicina sakņu veidošanos. • Sintēzes inhibitori veicina bumbuļu, gumu un sīpolu veidošanos. • Sintēzes inhibitori sekmē aklimatizāciju.

27. Rezumē II :Paklobutrazols, flurprimidols un ancimidols inhibē giberelīnu sintēzi un sekojoši samazina dzinuma garumu

28. CitokinīniCitokinīnus izmanto audu kultūrās galvenokārt divu funkciju dēļ: tie stimulē šūnu dalīšanos, kā arī veicina organisma atjaunošanos, juvenilizē augu. Citokinīni sintezējas lapās.

29. Dabīgie, tātad augos endogēni atrastie citokinīni ir yzeatīns (nosaukums radies no Zea mays, no kā zinātnieks Letham to 1964.g. pirmo reizi izdalīja), tā ķīmiskais nosaukums - 6-[4-hidroksi-3-metil-but-2-enilamino]purīns (Z), oizopenteniladenīns jeb 6---(dimetilallilamino)purīns jeb N6-[2-izopentenil]adenīns (2iP) (IPA),pDL-dihidrozeatīns (DHZ), kā arī šo savienojumu ribozīdi.

30. Endogēnie citokinīni ir atrasti augos gan konjugētā (neaktīvā), gan fosforilētā (aktīvā) formā. Ilgu laiku6-benzilaminopurīns (BAP) tika lietots kā sintētiskais preparāts, taču pēdējā laikā arī tas tiek uzskatīts par dabīgo citokinīnu.

31. Mākslīgi sintezēti savienojumi ar citokinīnu aktivitāti ir gkinetīns jeb 6-furfurilaminopurīns (Kin), kā arī vairāki savienojumi, kas nav purīni, kāgtidiazurons jeb (1-fenil-3-(1,2,3,-tiadiazol-5-il)urea (TDZ), gCPPU. Tiem ir augsta citokinīnu aktivitāte, un tos galvenokārt izmanto kokaugu audu kultūrās.

32. Kinetīns ir izdalīts no DNS hidrolīzes produktiem. Tas aktivē aminoskābju ieslēgšanos polipeptīdu ķēdēs, pastiprinot olbaltumvielu biosintēzi. • Kin. 0,001 mg.L-1 koncentrācijā stimulēja sakņu augšanu tomātiem; 0,1 un 0,122 mg.L-1 konc. – izraisīja dzinuma aizmetņu veidošanos uz saknēm.

33. Ja kinetīnu eksperimentā lietoja 0,0125 – 0,00625 mg.L-1 konc. un saharozi – 0,75-3 %, tad • pie augstas saharozes koncentrācijas kinetīns stimulēja, • pie zemas – kavēja tomātu sakņu augšanu.

34. Augsta citokinīnu aktivitāte konstatēta arī aromātiskam savienojumam, kas izdalīts no Populus - • meta-topolīnam(N6-(3-hidroksibenzil)adenīnam), saīsināti - mTun tā atvasinājumiem, kā • N6-(3-metoksibenzil)adenīnam jeb (mOCH3), • N6-(3-metoksibenzil)adenozīnam - (mOCH3-9R), • N6-(3-fluorobenzil)adenīnam - (mF) un • N6-(3-fluorobenzil)adenozīnam- (mF-9R).

35. Piemēram, 2004.gadā simpozijā “In Vitro Culture and Horticultural Breeding” Ungārijā, Debrecenā I.Bogaert, S.Van Cauter, E.Prinsen, K.Doležal un S.Werbrouck savā plenārreferātā “A new aromatic cytokinin can make the difference” ziņo, ka eksperimentos ar Petunia hybrida un Rosa hybrida šiem savienojumiem ir bijusi liela loma:

36. Savienojums mF-9R 2,5 μM koncentrācijā devis lielāko pavairošanās koeficientu rozēm, kam proliferācijas izraisīšanai parasti lieto BAP, bet 2,5 μM mOCH3-9R – labāko anti-senescences efektu. Salīdzinājumam: pēc 18 nedēļām barotnēs bez mOCH3-9R, puse no rožu dzinumiem in vitro bija gājuši bojā. Rozēm mikrokultivēšanas procesā laiku pa laikam veidojas apikālās vai dzinumu nekrozes, ja tās nepārstāda ik pēc 4-6 nedēļām.

37. Savukārt zaļi-balti-zaļi -lapainai petūnijai, kam bija nepieciešams nodrošināt šīs histoģenētiskās kompozīcijas stabilitāti mikrokultivēšanas gaitā, pielietoja 1-2 μM mOCH3-9R, kas bija optimālais citokinīns normālai šīs himēras pavairošanai. BAP turpretī petūnijai iniciēja daudz adventīvo dzinumu, kas noveda pie lielas daļas nenormālu dzinumu veidošanās.

38. Pirms apmēram 30 gadiem konstatēja, ka ekstrakts no Brassica napus putekšņiem izraisa stumbra stiepšanos garumā un šūnu dalīšanos. Aktīvie komponenti tika identificēti kā steroīdi un nosaukti par brassinosteroīdiem. Eksperimentos arvien vairāk un vairāk tiek apliecināts, ka tie ir augu hormoni. Robežās no nmol.L-1 līdz  mol.L-124-epibrassinolīdi jeb (22R.23R.24R)-2a.3a.22.23-tetrahidroksi-B-homo-7-oksa-5a-ergostan-6-one (24-EB) izsauc protoplastu dalīšanos un hipokotila stiepšanos garumā, bet inhibē sakņu pagarināšanos. Tiem ir nozīme vadaudu diferenciācijā. Vairāki zinātnieki konstatējuši uzlabojošo efektu stresa fizioloģijā, pielietojot 24-EB.

39. Rezumē (pamatiedarbība uz audu kultūrām): • Adventīvo dzinumu veidošanās • Sakņu veidošanās inhibēšana (ne visos gadījumos) • Šūnu dalīšanās • Kallusa veidošanās un augšana • Sānu pumpuru augšanas stimulēšana • Dzinuma stiepšanās inhibēšana • Lapu senescences inhibēšana

40. Uzskata, ka par citokinīnu sintēzes inhibēšanu atbild lovastatīns, bet degradācija un iedarbība nav pietiekoši izpētīta un ir neskaidra

41. Kopumā 26 citokinīni piedalās augu hormonālā regulācijā (Van Staden et.al, 2004).

42. AbscizskābeAbscizskābi (ABS) izolēja no augiem vairāk nekā 30 gadus atpakaļ. Tai ir loma embriju, pumpuru un sīpolu miera periodā, tā izraisa lapu nomešanu. Audu kultūrās ABS inhibē dzinumu augšanu. ABS akumulējas sausuma stresa apstākļos.

43. Rezumē (galvenā ietekme audu kultūrās): • Somatisko embriju nobriešanas sekmēšana. • Aklimatizācijas veicināšana. • Sīpolu un bumbuļu veidošanas stimulēšana. • Miera perioda norises sekmēšana.

44. FluridonsABS sintēzes inhibitors (K.Kwang-Soo, E.Davelaar, G.J.DeKlerk, 1994), tā iedarbība noris caur karotinoīdu sintēzes bloķēšanu. Kad fluridons bloķē vienu no karotinoīdu sintēzes posmiem, arī hlorofila sintēze tiek bloķēta. Ja barotnei pievieno fluridonu, tad ABS koncentrācija augos ir zema, un augi kļūst bāli. Toties ir literatūras dati par fluridona sekmīgu izmantošanu in vitro, lai pārtrauktu miera periodu.

45. Augu barošanās aklimatizācijas procesāK.W. Mudge, J.P. Lardner 1992.g. publicē darbu “Effects of lighting and CO2 enrichment on acclimatization on micropropagated woody plants”. Autori ziņo, ka ir konstruējuši kameru, piemērotu bagātināšanai ar CO2, lai komerciāli aklimatizētu in vitro savairotus augusex vitro.

46. Viņi konstatējuši, ka šādu paņēmienu var sekmīgi piemērot kalnu lauru kokam, ceriņiem, vīnogām, ābelēm un avenēm, bet nevar zilenēm, saldiem ķiršiem, pīlādžiem. Tādas kultūras kā ābeles un pīlādži ātri proliferē, bet tiem ir lieli zudumi aklimatizācijas procesā, kas padara šo lietu nerentablu.

47. K.W. Mudge un & konstruējuši kameru ar 2x3 faktoru variācijām, t.i., ar diviem CO2 līmeņiemun trim dažādām gaismas intensitātēm. CO2 devas –450±50 un 1200±200 ppm 3 dažādās gaismas intensitātēs variēja atkarībā no kultūras. Tā, lauram ‘Carousel’ labākais variants bijis 1200 ppm CO2 un 100 µmol/m2/s apgaismojuma, ceriņam ‘RVH’- 1200 ppm CO2 un 80-130 µmol/m2/s gaismas intensitāte. Autori konstatējuši arī, ka visiem pārstāvjiem no Rosaceae dzimtas, kas viņiem bija, novēroja dzinuma “stāvēšanu uz vietas” aklimatizācijas laikā. Tad viņi pielietoja G3.

48. Simpozijā “In Vitro Culture and Horticultural Breeding” 2004.g. Debrecenā japāņi (T.Kozai et.al.) ziņo par 100-160 µmol.mol-1CO2 pielietošanu in vitro dažādu augu kultivēšanā lielos traukos bez cukuriem, aminoskābēm un vitamīniem, īpaši ataudzēšanas un apsakņošanas fāzēs. Tādā gadījumā augs in vitro jau ir aklimatizējies, un izstādīšana ex vitro noris bez problēmām.

49. Normāli augus pēc izstādīšanas substrātā sāk barot tad, kad tie uzrāda pirmās augšanas pazīmes, bet var reizi nedēļā miglot ar 1/10 daļu no MS (Murashige and Skoog, 1962) neorganisko sāļu barotnes. Katrā gadījumā tas ir ļoti individuāli katrai kultūrai.

50. Paldies!un gatavosim barotnes24.februārī NBD Salaspilīpl.1430! 