BUTS IMMUNOINTERVENTION

BUTS IMMUNOINTERVENTION Reconstitution d’un système immunitaire défaillant - hormones thymiques - gammaglobulines • thérapie cellulaire (greffe de cellules souches, moëlle, thymus…) - thérapie génique (ADA, gc) I - IMMUNOSTIMULATION Stimulationspécifique d’un antigène - vaccins (adjuvants + Ag) Stimulation non spécifique d’un Ag = immunostimulants - extraits bactériens, fongiques, cytokines; vitamines, produits chimiques

BUTS IMMUNOINTERVENTION INDICATIONS Traitement des déficits immunitaires Vaccins préventifs (prophylactiques) curatifs (thérapeutiques) Augmentation de la Réponse immunitaire (défense anti-infectieuse, anti-tumorale)

II - IMMUNOSUPPRESSION - Induction de tolérance : AG (  couplé) - Neutralisation de molécules fonctionnelles AAc anti-molécules de reconnaissance (TCR) ou associées à la reconnaissance (CD3, CMH) Stratégies anti-molécules d’activation (Ac anti-B7, CTLA4 Ig, Ac anti-CD40) Immunosuppression spécifique de la réponse immunitaire Ac anti-molécules d’adhérence (ICAM, CD2, LFA) Stratégies anti-cytokines ou anti-récepteurs de cytokines - Désensibilisation spécifique (allergènes) - Immunosuppression spécifique des Lc activés (Cyclosporine A) Immunosuppression non spécifique d’une réponse immunitaire - Destruction des cellules lymphoïdes (thymectomie, irradiation…) - Substances antiprolifératives (analogues des purines, agents alkylants) - Immunosuppresseurs (corticostéroïdes…)

II - IMMUNOSUPPRESSION INDICATIONS Prévention du rejet de greffes Maladies autoimmunes Allergies et inflammation Conditionnement cellules (Thérapie cellulaire)

ELEMENTS-CLES DE LA REPONSE IMMUNITAIRE POUR L’IMMUNOINTERVENTION Récepteurs pour l’Ag (TCR, BCR) et présentation AG Molécules membranaires associées (CD3, CD4, CD8, motifs ITAM) Signaux d’activation cellulaire - Protéines cellulaires - voies transduction signal - facteurs de transcription Molécules d’adhérence Sélectines (CD62) Intégrines (LFA1, LFA3) Superfamille des Ig (ICAM1, ICAM3) Cytokines et récepteurs de cytokines (IL2, IFNg, TNF)

Cellule dendritique Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Macrophage Lymphocyte B B7 Au repos Activé Au repos Activé Molécule de classe II du CMH LPS IFN g Molécule de classe I du CMH Capture de l’antigène Endocytose médiée par un récepteur Endocytose médiée par un récepteur Endocytose Phagocytose Phagocytose Phagocytose Expression CMH classe II Constitutive (+++) Inductible (-) Inductible (++) Constitutive (++) Constitutive (+++) Activité de Costimulation (B7) Constitutive (+++) Inductible (-) Inductible (++) Inductible (-) Inductible Cellules T naïves Cellules T effectrices Cellules T mémoire Cellules T naïves Cellules T effectrices Cellules T mémoire Activation des cellules T Cellules T effectrices Cellules T mémoire Cellules T effectrices Cellules T mémoire (-)

Ag Ag TCR BCR VH VL Domaine de la superfamille des immunoglobulines CH CL Ag Motif ITAM Va Vb Ca Cb s Ig a b Iga Igb Igb Iga d e e g CD3 CD3 Seconds messagers z z

CD4 TCR ab + CD3 a b Recepteurs membranaires CD45 e d e g Membrane plasmique Protéines Tyrosine-kinases P56 lck Protéines Intracellulaires phosphorylées ZAP-70 SLP-76 P59 Fyn Syk Cytoplasme RasGTP PLCg-1 Protéines Ras Protéine kinase C Inositol triphosphate z z IP3 Raf-1 DAG Ca++ Calmoduline Calcineurine MAPKK PKC NF-kB NF-ATp MAPK Membrane nucléaire Facteurs transcriptionnels NF-kB NF-ATc Jun/Fos NF-ATp • Gènes promoteurs : • des cytokines • du cycle cellulaire Noyau Gènespromoteurs

ACTIVATION LYMPHOCYTAIRE Réponse immunitaire : Ag, super Ag Stimuli non physiologiques - Ac activateurs : anti-CD3, CD28… - Lectines (PHA, ConA, PWM) - Ca Ionophore 1) INDUCTION Nécessité d’un second signal : • fourni par la cellule Pag • (CD40/CD40l; CD28/B7…) - Ligands PKC (PMA) 2) ACTIVATION Activation PLC conversion du PIP2 en : • IP3 mobilisation Ca 2+ • - DAG activation PKC Activation PKC Phosphorylation protéines intracellulaires - voie PKC (phosphorylation des résidus sérine des chaînes g, d et e (CD3) - voie PTK (phosphotyrosine kinases) P56lck (associé à CD4, CD8) P59fyn (associé à CD3/TCR) Activation = état transitoire : phosphorylations contrôlées par des phosphatases (notamment sur CD45) : 1, 2 A et calcineurine (phosphatase 2B)

ACTIVATION LYMPHOCYTAIRE translocation de facteurs de transcription transduction de signaux vers le noyau transcription de nombreux gènes impliqués dans le cycle cellulaire (c-fos, c-myc) 3) PHOSPHORYLATION DE PROTEINES CYTOPLASMIQUES impliqués dans la régulation de l’activation (kinases, phosphatases) codant pour cytokines, récepteurs de cytokines (IL-2, IL-2R) et CMH II 4) EXEMPLE DE LA REGULATION DU GENE DE L’IL-2 Fixation (coordonnée) de = facteurs de transcription sur des régions régulatrices situées en amont du promoteur de l’IL-2 (NFAT, NFKB, OCT-1, AP1, AP3) transcription du gène IL-2 et synthèse IL-2 Sécrétion IL-2 en phase G1 du cycle cellulaire Même processus pour IL-2R (chaîne a = P55 = CD25) qui se lie à chaîne b Récepteur de forte affinité IL-2 se lie à IL-2R complexe internalisé progression du cycle cellulaire et activation de nombreux gènes (HSP, CD71) passage à Phase S synthèse ADN Puis : phase G2 M.

Régions régulatrices situées en amont du promoteur du gène de l’IL - 2 NF -AT AP-3 NF -kB OCT – 1p AP - 1 154 284 264 208 188 138 85 65 PHA + PMA aCD3 + PMA aCD28 + PMA PMA PHA aCD3 aCD28 PMA PHA aCD3 aCD28 PMA Initiation de la transcription de l’ IL - 2 Produits inducteurs Initiation de la transcription de l’ IL - 2 Produits inhibiteurs Cy A FK 506 Cy A FK 506

Cellule Th Antigène LFA - 3 CD 2 LFA - 1 Peptide ICAM - 1 - S – S - Molécule de classe II du CMH TCR - CD 3 CD 4 CD 22 CD 45 CD 28 Cellule présentatrice de l’antigène B7 - S – S -

Cellule Tc Antigène LFA - 3 CD 2 LFA - 1 Peptide ICAM - 1 - S – S - TCR - CD 3 Molécule de classe I du CMH CD 8 CD 22 CD 45 Cellulecible

- S – S - - S – S - - S – S - - S – S - - S – S - - S – S - - S – S - - S – S - - S – S - - S – S - CD 28 B 7 APC Cellule Th B 7 CTLA - 4

Des Lc « innés »: les LcT gamma delta et les NKT Lc NKT(alpha beta) etLc T gamma delta et : LcT « innés »: - cellules protectrices anti-tumorales(« immunosurveillance ») et maintenant l’homéostasie tissulaire - cellules régulatrices dans l’autoimmunité, les infections et l’inflammation Ces LcT innés répondent à des antigènes du « soi » - Souvent induits par le stress, les lésions ou la transformation tumorale - mais très peu de ligands identifiés ( AG non peptidiques) Dans les 2 cas , cellules cytotoxiques - exocytose de molécules cytotoxiques(granulysine, perforines, granzymes) - contact cellulaire : interaction Fas/Fas ligand - récepteur activateur/inhibiteur: expression de NKG2D: récepteur activateur (ligands : famille CMH classe I ( MIC A/ MICB) et NKG2A-KIR: R Inhibiteur

Une sous-population particulière de lymphocytes: les Tgd

Les lymphocytes T gd B DC Tab NKT NK M Tgd • 1983: gènes murins codant pour les chaînes g et d d’un nouveau TCR • TCR gd exprimé à la surface de lymphocytes T murins • lymphocytes T gd dans le sang, la peau, les muqueuses des vertébrés • sang humain adulte:1-10 % de lymphocytes T gd 50 à 90% sont Vg9Vd2 (CD3+ CD4- CD8- ). • Interviennent comme intermédiaire entre l’immunité innée et l’immunité adaptative: Récepteurs innés Récepteurs réarrangés

Organisation des loci des chaînes get d des récepteurs des cellules T humaines Locus de la chaîne a L Vx70-80 Jx61 C Locus de la chaîne g Cg 1 Jx2 Cg 2 L Vx12 Jx3 Locus de la chaîne d Dx3 Jx3 C • L’organisation générale des loci du TCR gd ressemble à ceux du TCR ab avec quelques différences

Ontogénie des LTgd Thymocytes double négatifs CD3-4-8- Compétition entre les signaux via le TCRgd et le récepteur de cellule pré-T (modèle compétitif) g : d TCR Pré-TCRab g:d+CD3+4-8- Grands thymocytes double positifs CD3+pTa:b+4+8+ g : d TCR Pré-TCRab minoritaires Quand ils sont mâtures, ils migrent hors du thymus

Vagues cellulaires chez la souris • Expression des chaînes TCR au cours du développement murin et répartition tissulaire

Structure du TCR gd d g a b g d Domaines V V Domaine variable D J Domaine constant Domaines C Charnière Région transmbr 110° 147° Extrémités intracytoplasmiques • Similarité globale mais une différence majeure Nature vol 411 June 2001 p820-824

LT gd versus LT ab • Développement dépendant ou non du thymus. • Absence de restriction par le CMH, capacité de reconnaître des protéines solubles ou des antigènes non protéiques. Caractéristiquesab T cells gd T cells B cells Récepteurs complexe CD3 +TCR complexe CD3 +TCR Ig Répertoire théorique ~1015 ~1020 ~1011 Antigène peptide protéine et non protéine protéine et non protéine Restriction/CMH oui rare non Distribution sang (65-75%),tissus sang(1-5%), épithélium, sang(5-10%) et tissus lymphoïdes tissus lymphoïdes lymphoïdes Capacité CTLs (CD8), Th1/Th2 CTLs, Th1>Th2 production d’Ig Fonction protection immune immunorégulation immunité humorale éradication pathogènes immunosurveillance CTLs: cytotoxic T lymphocytes, Ig: immunoglobulines, TCR:T-cell receptor

Réponse des LT gd humains gd gd tumeurs infections Th1 cytokines phosphoantigens Vg9Vd2 Tcells Proliferation Cytotoxicité + IL2 Cellules Mémoire Chimiokines

Reconnaissance de phosphoantigènes par les LTgd Ag cible TCR CMH I +- KIR gd T cell Orientation de la réponse cellulaire +Contact cellulaire indispensable

Synthèse d’un phosphoantigène agoniste du TCR gd: le BromoHydrine PyroPhosphate Sélectionné pour sa bonne superposition avec des ligands naturels Stockage -20°C en solution aqueuse pendant 4 mois sans dégradation The Journal of Biological Chemistry Vol. 279 No.21 pp 18337-18344, 2001

Propriétés biologiques du BrHPP Le BrHPP stimule les LcTgd comme les phosphoantigènes naturels Sécrétiond’IFNg et TNFa par les gd en culture en réponse au BrHPP • Cet agoniste synthétique permet l’étude détaillée des fonctions des LcTgd • Et pourrait stimuler la fonction anti-tumorale des LcT gd The Journal of Biological Chemistry Vol. 279 No.21 pp 18337-18344, 2001

FONCTIONS DES LYMPHOCYTES gdDANS LES INFECTIONS • Bactéries (Mycobactéries, Listeria) • Parasites (Plasmodium, Toxoplasme, Leishmanies) - Virus (HSV) Mécanismes invoqués (souvent modèle souris): - Cytotoxicité directe vis-à-vis des microorganismes 1. Rôle protecteurvis-à-vis d’agents pathogènes intracellulaires: - Cytotoxicité contre les cellules infectées ou « stressées » - Sécrétion de cytokines qui activent d’autres cellules(ex: NK) 2. Rôle anti - inflammatoire • Dans la phase terminale de la réponse immune (Listeria) >>>>Production d’IL-10 • Role immunorégulateur (selon le type de gamma/delta) • >>>>>Infections / allergies

CHEZ L’ HOMME • 2 types de ligands • >>Large distribution des phosphoAG capables de stimuler les γ9δ2 • chez les pathogènes (mais très peu de ligands identifiés: Mycobactéries et Plasmodium) Groupement phosphate pour les g9d2 - Augmentation des Lc T gd périphériques au cours des infections Alkylamines pour les g2d2 (présence dans bactéries comme Listeria, S.typhimurium, Y.enterocolitica, E.coli, Bacteroides fragilis, Clostridium perfringens) >>Production par la flore bactérienne intestinale - Immunité innée et adaptative • Notion d’hétérogénéité des Tgamma delta: • >> périphériques / tissulaires >> CD4+ / CD8- : cytokines+++/peu cytotoxiques) CD4- CD8- et CD4- CD8+ : peu cytokines / très cytotoxiques >>Cytokines Th1 versus Th2

Implication des LTgd durant la tuberculose • Modèle souris: rôle dans l’afflux de cellules inflammatoires au foyer de l’infection [D’Souza,1997,J.Immunol. 158] • Chez l’homme: certains LT gd expriment à haut niveau la granulysine (protéine microbicide) [Spada 2000 J.Exp.Med. 191] • Vg9Vd2 humains capables de tuer des mycobactéries intracellulaires [Dieli 2001 J.Infect.Dis., 184] • Expansion de Vg9Vd2 coïncide avec la disparition du BCG [Shen 2002,Science, 295]

Présence des cellulesgd suite à l’infection par Mycobacterium bovis (BCG) chez la souris • Nombre de lymphocytes Tgd dans le poumon après infection par le BCG: • gd • BCG • ab Utilisation des chaînes du TCR: The Journal of Immunology 2003, 170:463-469

Cytotoxicité de ces lymphocytes Tgd chez la souris infectée par du BCG Intervention du TCRgd dans la cytotoxicité contre des macrophages infectés par du BCG (anticorps bloquants): EDTA et Sr 3+ inhibent la cytotoxicité des LTgd E exocytose de granules The Journal of Immunology 2003, 170:463-469

Rôle potentiel des cellules T gd lors des infections bactériennes • gd capable de tuer cellules infectées par bactéries • Produire un haut niveau d’IFNg et TNFa (macrophage) • Facilite la réponse adaptative par les cellules T ab • Déplétion de gd E m production IFNg par NK, formation granulome+lente, kcroissance bactérienne • Régule les fonctions immunes des DC et des cellules B • Répare les tissus durant l’infection (KGFs) TRENDS in immunology vol.24 No.4, 2003

Amélioration du vaccin existant (BCG) par la participation des lymphocytes T gd??? • Contribution des cellules Tgd à l’immunité induite par le vaccin BCG E développement d’un vaccin contre la tuberculose plus efficace ? FACS: CF= Filtrat de culture de mycobactéries PBMC in vitro Prolifération desgd Production d’IFNg par les gd: Cochons vaccinés (5semaines) Infection and Immunity 2004, p.1504-1511

Les cellules Tgd en tant que vaccin potentiel??? • Grande et rapide capacité d’expansion dans les infections mycobactériennes. • Réponse de type mémoire après une réinfection. E obtention possible d’une immunité VgVd obtenue par un vaccin ? Macaques infectés par du BCG: Sang périphérique Science vol. 295, 2002

Lc T gd et MALARIA • Augmentation du nombre de T gd au cours des infections • à Plasmodium falciparum: • >>>crises paroxystiques chez sujets non immuns • >>>dans rate de sujets DCD de malaria cérébrale • >>>chez enfants traités: • 30 à 50%des LcT , Vdelta 1 • IFNg+++

% gd cells in PBL of malaria patients 0 5 10 15 20 25 30 Non endemic non malarial paroxysm infection convalescence Endemic paroxysm infection convalescence from M. Perera et al, 1994, J.Exp. Med.

Lc T gd et MALARIA • Augmentation du nombre de T gd au cours des infections à Plasmodium falciparum • Identification de phosphoAG activant les T gd périphériques • (surtout les g9 d2) au stade schizonte): effet « superantigène » - Activation des gamma delta ( HLA-DR+++) mais expansion variable des gd selon les études (souches de parasites et background génétique de l’hôte) : g9 d2, g2d2, d1

Lc T gd et MALARIA • Rôle protecteur: • >>in vitro: γ9 δ2, Vδ 1 et vδ2 inhibent réplication stades asexués(pas les αβ) • (cible: MRZ; nécessite un contact cellulaire; rôle des molécules cytolytiques et pro-inflammatoires ) • >>in vivo: • -protection vis-à-vis du stade SPZ de P yoelii chez souris alpha beta déficientes immunisées : cytotoxicité des γδ sur hépatocytes infectés (M. Tsuji ) • - exacerbation parasitémie(P chabaudi) chez souris gd déficientes( J. langhorne) - Rôle en pathologie (TNF) • Rôle immunorégulateur • des T γδsur LcT alpha beta (Réponse Th1+++) • des T alpha beta ( activation des gamma delta via l’IL -2 ou l’IL-15)

Lc T gd et VIRUS • - Nombreuses évidences chez la souris du rôle protecteur des T γδvis-à-vis de virus (HSV1) • Chez l’homme : ++gamma 9 delta 2 chez patients séro+ pour HSV1 ou • convalescents MNI (infection EBV) • résultats contradictoires pour sujets HIV • Chez sujets greffés rénaux + infection CMV: • +++T gamma delta périphériques après l’infection et persistants + 1an • ils sont activés: HLA DR++, CD8+ mais pas de phénotype mémoire (CD45RO-) • surtout Vdelta 1 et Vdelta 3

Lc T gd et VIRUS 2. Rôle des gamma 9 delta 2 périphériques - Chez sujets HIV + et CMV greffés , pas d’augmentation de gamma 9 delta 2, suggérant que dans ces infections virales les Lc T gamma delta périphériques ne répondent pas à des ligands phospho-antigénes - dans infection HSV, détection de T gamma 9 delta 2 cytotoxiques pour cellules infectées 3. Rôle des muqueuses - voie d’entrée muqueuse des virus - or dans épithélium intestinal , 70 à 90% des Lc T gamma delta sont V delta 1 et seuls ligands connus de V delta 1 sont molécules MICA et MIC B (famille MHC), dont l’ARNm augmente dans les cellules épithéliales en situation de stress >>>hypothèse: dans infection à CMV ou HIV: activation des T gamma delta dans épithéliums en réponse à ds Ag viraux ou des composants cellulaires non spécifiques(MICA/MICB) puis migration vers sang périphérique

CD1d TCRab NK1.1 Natural Killer T cells in Microbial Immunity * Regulatory cells: activate the innate and adaptive immune responses * Effector cells: killing activity Host defense against microbial pathogens

APC APC MHC Class I, class II Peptides (glyco)lipids CD1 TCRab TCRab Lipid-reactive T cells Non-conventional T cells Peptide-reactive T cells Conventional T cells Evolutionary conserved highly biased TCR Hypervariable TCR

Characteristics of NKT cells • Phenotype of innate/memory cells • * Expression of markers indicative of an activated/memory phenotype • found on conventional T lymphocytes (CD69, …) • * Expression of markers associated with the innate non-lymphocyte NK • lineage (Ly49, NKG2d, NK1.1, ..) • Very rapid production of cytokines upon stimulation of TCR: • IFNg AND IL-4 3) Cytotoxic activity (intracellular microorganisms, tumors) *Perforin/granzyme * Fas/FasL First line of defense against infection and modulate downstream development of acquired immune responses mediated by T and B cells

CD1 family Expressed on APCs, thymocytes, intestinal epithelial cells Require endosomal localisation and trafficking (exogenous pathway) Deep Ag binding hydrophobic pocket * Group 1 (CD1a, b, c): in humans (not in rodents) Lipids from mycobacteria * Group 2 (CD1d): in most species examined Self-Ags (steady state conditions, inflammation) Exo-Ags (pathogen-derived) CD1d-restricted T cells, including NKT cells

a galactosyl ceramide sulfatide (cerebroside sulfate) ganglioside (GD3) phosphatidylinositol mannoside (PIM) Jahng et al., J. Exp. Med. 2004 Wu et al., J. Exp. Med. 2003 Fischer et al., PNAS 2004 Kawano et al., Science 1997 What Ags are presented by CD1d ? C18 C26 exogène endogène

APC (glyco)lipids CD1 TCRab iNKT cells IL-10 TGF IFN-g IL-4 Naive conv T cells Th1/Th2 differentiated T cells

NKT cells ? IFN-g IL-4 IFN-g Type 1 cytokine producing T cell Naive T cell IL-4 IL-5 IL-13 Type 2 cytokine producing T cell

Factors that influence the immuno modulatory activities of NKT cells * Nature of the ligands (affinity for the TCR) * Nature of the APC * Cytokine environment * Duration and frequence of stimulation * Host genetic background

BUTS IMMUNOINTERVENTION