Le molecole chiave dell’apoptosi

2. Le molecole chiave dell’apoptosi • P53 • Caspasi • Bcl2 family • IAP family • Death Receptors

3. IAP family • IAP = Inhibitor of Apoptosis Protein • proteine endogene che funzionano come regolatori intrinseci della cascata delle caspasi • legandosi alle caspasi (anche già attivate) ne inibiscono l’attività enzimatica e ne promuovono ubiquitinazione e degradazione • le prime IAP furono identificate nel baculovirus -> conservate in drosophila e nei vertebrati

4. BIR domain: baculoviral IAP repeat (70-80 aa), responsabili per l’interazione con le varie caspasi. Interazioni con specifiche caspasi sono attribuite ai singoli BIR domains (BIR3-Casp9, BIR2-Casp3/7) • RING Finger: Zn-finger domain capace di chelare due atomi di Zn. Si trova di solito in proteine che funzionano come E3-Ub ligasi (adattatori che reclutano un substrato per un enzima E2 specifico -> targeting per la degradazione proteasoma-mediata)

5. Regolatori negativi delle IAP • proteine in grado di legare le IAP sopprimendone l’attività antiapoptotica • XAF-1, XIAP-Associated Factor-1: legando XIAP blocca la suaazioneinibitricesu Casp-3 e reverte la suaazione protettiva verso l’apoptosiindotta da chemioterapici. Espresso a buonilivelli in tuttiitessuti, èinvece estremamente basso nellamaggioranzadellelineecellulari di originetumoraleusatenellaricerca di laboratorio. La perditadell’espressione di questaproteinanelle cellule trasformatepotrebbecontribuireallamaggiorresistenza all’apoptosichecaratterizza le cellule tumorali.

6. Smac, second mitochondria-derived activator of caspases. Proteinanormalmenteresidenteall’interno del mitocondrio e rilasciatanelcitoplasmaduranteilprocessoapoptotico. E’ un dimero in grado di legarsi a XIAP, IAP-1/-2 e Survivin Si legaaglistessi BIR domain legatidallecaspasi -> inibiscel’azioneantiapoptoticadelle IAP per competizione o spiazzamento.

7. Le molecole chiave dell’apoptosi • P53 • Caspasi • Bcl2 family • IAP family • Death Receptors

9. tumor suppressor • mutata nel 50% di tumori umani: è la lesione genetica più frequente P53 • le mutazioni osservate nei tumori clusterizzano principalmente nella regione responsabile del legame al DNA • conservataneivertebrati, possiedeomologhi anche in drosophila e c.elegans

10. organizzata in 4 domain funzionali, la suafunzione èfinementeregolata a piùlivelli: - fosforilazione, acetilazione-> degradazione • è un fattore di trascrizioneedagisce in forma di omotetramero • regola la trascrizione di gruppi di genicoinvolti in - arresto del ciclocellulare - apoptosi - senescenza

11. proteina molto instabile, i cui livelli sono mantenuti costantentemente bassi all’interno della cellula tramite degradazione mediata dalla proteina Mdm2 • i suoi livelli cellulari aumentano per mancata degradazione (inattivazione di Mdm2) • aumento in seguito a danno del DNA (UV, raggiX, chemioterapici) -> due principaliconseguenze: - arresto del ciclocellulare (danno moderato) - apoptosi (danno forte)

13. PUMA NOXA

14. Pathways anti-apoptotici

16. Invecchiamentocellulare e dell’organismo

17. Invecchiamento • Un problemasociale di enormeimportanzanelmondooccidentale; • L’ItaliaéunodeiPaesipiúvecchi del mondo.

18. Invecchiamentopatologico e invecchiamento “fisiologico” • Malattie la cui incidenza e le cui manifestazioni sono maggiori con l’avanzare dell’etá: cancro, arteriosclerosi e malattie cardiovascolari, p.es. • Accanto a queste “malattie”, l’invecchiamento si manifesta con una complessa serie di “sintomi” legati al progressivo decadimento delle funzioni cellulari • Sembrerebbe quindi che la medicina debba o: 1) scoprire cure specifiche per ogni specifica malattia collegata all’invecchiamento, oppure 2) intervenire sull’invecchiamento “fisiologico” per rallentare le manifestazioni “patologiche”.

19. Non tutte le specie invecchiano nello stesso modo • Varie modalità di invecchiamento, varie velocità, varie caratteristiche • generalmente associate al processo riproduttivo • Tre tipi di senescenza: • improvvisa • immediata, post-riproduttiva • graduale • periodo post-riproduttivo in cui insorgono gradualmente fenomeni di invecchiamento • non dimostrabile • non esiste un periodo post-riproduttivo

20. Non tutte le specie invecchiano nello stesso modo • Varie modalità di invecchiamento, varie velocità, varie caratteristiche • generalmente associate al processo riproduttivo • Tre tipi di senescenza: • improvvisa • immediata, post-riproduttiva • graduale • periodo post-riproduttivo in cui insorgono gradualmente fenomeni di invecchiamento (CI SIAMO ANCHE NOI QUI) • non dimostrabile • non esiste un periodo post-riproduttivo

21. Senescenzaimprovvisa • Avvienedopo la riproduzione • ilperiodo pre-riproduttivopuòdurare...secoli! • Insetti: • allametamorfosil’adulto non ha apparatodigestivo (!!!) • consuma le sue riserve di energiadurante la riproduzione • in alcuniragni (3-4 cm) le riservepossonodurareanche 1 anno • Apiedinsettisociali: enormevarietà di estensionedella vita con lo stessocorredogenetico • maschi: muoionodurante la riproduzione • lavoratori: non siriproducono, hannounadurata di vita variabile in funzionedellastagione • regine: campanofino a 4-5 anni, muoionoall’esaurimentodellaspermotecaaccumulatanelvolonuzialeuccisedalleapilavoratrici • Vertebrati: • Salmone del Pacifico (migradall’Oceanoalleacquedolci per riprodursi e qui muore) • Attivitàneuro-endocrina->ipercortisolismo->invecchiamentorepentino (nell’Uomo: sindrome di Cushing) • interruzionedell’alimentazione • degenerazionedelle cellule intestinali • perditadelleriserve di grassocorporeo • aterosclerosiaccelerata • degenerazione di alcuniorgani (fegato, rene) edimmunodeficit (malattieinfettive)

22. Senescenza non dimostrabile • Alcune specie apparentemente non invecchiano e continuano ad avere cicli riproduttivi indefinitamente • piante conifere (sequoie): > 5000 anni • Animali: • molluschi, crostacei (aragoste >20kg, >100 anni almeno), tartarughe (>150 anni) • Non c’è evidenza di un periodo post-riproduttivo • Non sono evidenti i fenomeni associati all’invecchiamento • Non aumenta la probabilità di morte all’aumentare dell’età

23. Perchè invecchiamo?

24. Teoria “evolutiva” della senescenza • Dal momento che le alterazioni collegate all’invecchiamento si manifestano nell’etá post-riproduttiva, non c’é stata pressione evolutiva per l’eliminazione/mutazione di geni “nocivi” a questo stadio, ma: • Se questi ipotetici “geronto-geni” esistono, essi potrebbero essere favoriti dall’evoluzione se giocano un ruolo positivo per la fitness/riproduzione • L’invecchiamento come “by-product”

25. Aging before cell phones …….. "Protected" Environment (climate control, biomedical intervention etc.) 100% SURVIVORS "Natural" Environment (hazards, predators, infection, etc.) HUMANS: MICE: 4 mos 40 yrs 80 yrs 3-4 yrs AGE

26. Aging before cell phones …….. "Protected" Environment (climate control, biomedical intervention etc.) 100% "Natural" Environment (hazards, predators, infection, etc.) SURVIVORS AGE Mutation Accumulation("bad" genes can persist) Antagonistic Pleiotropy (what's good when you're young can be bad when you're old)

27. Invecchiamentocellulare

28. Tutte le cellule invecchiano? Ci sono sottopopolazioni di cellule il cui invecchiamento ha più importanza?

29. Invecchiamento delle cellule staminali • Le cellule staminali possono accumulare danni ed andare incontro ad invecchiamento/morte come tutte le altre cellule • La perdita del pool di cellule staminali può portare alla perdita del tessuto derivante • invecchiamento di cellule ad uno stadio differenziativo più avanzato ha un effetto via via più ristretto

30. Evidenze per la perdita delle cellule staminali “hair graying” dei topi

31. Anatomia cellulare dei follicoli/vibrisse del topo

32. Topi bcl2 -/- topi più vecchi topi più giovani

33. Invecchiamento del pelo • La perdita delle cellule staminali melanocitarie precede la perdita dei melanociti differenziati • La perdita del pool staminale (accelerata dalla delezione di bcl2) causa l’ingrigimento del pelo per la perdita della progenie differenziata con l’età • Fenomeni analoghi possono avvenire in tutti i tessuti

34. Lo studio della senescenza replicativa • Diversi tipi di cellule umaneprimarienormali (p.es. fibroblasti) messe in culturadopo un numerolimitato di replicazionicellularivannoincontro ad arrestoirreversibile del ciclocellulare e a modificazionimorfologiche denominate “senescenzareplicativa” (incapacitá a rientrare in ciclo)

35. Telomerase and telomeres • Telomeres - tips of chromosomes • Protect integrity of DNA at the ends of chromosomes • Telomerase - recognizes the end of the chromosome and adds repetitive telomeric sequences to maintain the length of the telomere

37. Cellule umane normali • La telomerasi non é espressa nella maggior parte dei tessuti normali • La replicazione cellulare (in assenza della telomerasi) causa un progressivo accorciamento dei telomeri • Quando I telomeri raggiungono una determinata lunghezza minima, le cellule vanno incontro a senescenza replicativa • L’invecchiamento cellulare sembrerebbe essere un meccanismo volto a ridurre il massimo numero di divisioni cellulari possibile, e sfavorire cosí l’accumulo di un numero elevato di mutazioni

38. Senescenza e danno al DNA • l’accorciamento dei telomeri mima un danno al DNA, portando all’innesco del programma di senescenza replicativa • L’incapacità di riparare il danno (dovuta all’assenza di telomerasi) innesca una DNA damageresponse cronica che porta ad invecchiamento cellulare (in alcuni casi, può portare anche ad apoptosi)

39. Accorciamentodeitelomeri e danno al DNA