TECNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR

1. Química Biológica Patológica TECNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR Aplicadas al diagnóstico de Enfermedades Genéticas IV- Parte Tema:1 (1)  Dra. Silvia Varas svaras@unsl.edu.ar

2. TIPO DE MUTACION DEFINE LA TECNICA DE BIOLOGIA MOLECULAR A USAR PARA EL DIAGNOSTICO MOLECULAR

3. 6,1% 15,8% 9,6% 11,2% 45,1% Espectro de diferentes tipos de mutaciones en genes humanos (Human Gene Mutation Database) • 14.363 mutaciones en 783 genes Mutaciones sin sentido  Mutaciones con cambio de sentido

4. MUTACIONES PUNTUALES • En la región regulatoria • En el splicing • Sin sentido (nonsense) • Con cambio de sentido (missense)

5. Grandes Deleciones Southern Blotting PCR Multiplex GAP-PCR MLPA Mutaciones Puntuales y deleciones pequeñas RFLP-PCR(ER-PCR) Mutagenesis mediada por PCR Alelo-Específicas: MAS-PCR ARMS- MARMS DOT-ASO Estrategias en el laboratorio de Biología Molecular

6. Desconozco la mutación o polimorfismo SSCP (single strand conformation polymorphism) DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) Estrategias en el laboratorio de Biología Molecular II

7. SSCP (Polimorfismos de conformación de cadena única) • SSCP (single strand conformation polymorphism) es un método simple y accesible para detectar alteraciones en la secuencia en un fragmento obtenido por PCR

8. SSCP (Polimorfismos de conformación de cadena única) • La técnica de SSCP detecta variaciones en la secuencia del ADN (mutaciones puntuales y otros cambios pequeños) debido a la generación de diferencias en la movilidad electroforética. • Bajo condiciones no desnaturalizantes, las moléculas de ssADN asumen conformaciones únicas que dependen de su secuencia de nucleótidos. • Los cambios conformacionales producidos por variaciones en la secuencia de ADN pueden resultar en diferencia de movilidad detectables.

9. Un par de primers específico es utilizado para amplificar el ADN blanco. La muestra se enriquece en ssADN por medio de una PCR asimétrica, debido a la presencia de uno de los primers en mayor cantidad que el otro. Las movilidades de los fragmentos simple cadena se comparan mediante electroforesis en un gel neutro de poliacrilamida. Las bandas son detectadas. Rápido enfriamiento

10. DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) simple complejo Los productos de PCR son cargados en un gel con un gradiente desnaturalizante Típicamente 20-80% formamida ADN doble cadena migra hasta encontrar su melting El melting es determinado por su secuencia y contenido de GC Las diferentes secuencias migran a diferentes distancias 20% 80%

12. Grandes Deleciones Southern Blotting GAP-PCR PCR Multiplex MLPA Estrategias en el laboratorio de Biología Molecular

13. Tipos de Blots • Southern Blot – transfiere DNA y la sonda o probe es de ADN • Northern Blot – transfiere RNA y la sonda o probe es de ADN • Western Blot – transfiere proteínas y la sonda o probe son anticuerpos.

15. The Southern blotting technique

17. Grandes Deleciones Southern Blotting PCR Multiplex GAP-PCR MLPA Estrategias en el laboratorio de Biología Molecular

20. PCR Multiplex Es una variante de PCR en donde dos o más loci son simultáneamente amplificados en la misma reacción. Cuidados especiales: 1-Los primers de 18-24 pb deben tener un contenido de GC 35-60% de esa forma tiene una T anneling de 55-58ºC o mayor. 2-Distribuir los amplicones de distintos tamaños. 3-Diseñar primers con características similares: sin estructura secundaria ni interacciones entre ellos. 4-Se debe calcular el Tm (no muy diferentes entre primers) y analizar las interacciones entre los primers).

21. PCR Multiplex Cuidados especiales II: 5- Se deberá optimizar: Tº extensión, Tiempo de extensión, Tiempo y temperatura de anneling, número de ciclos, cantidad de primers, concentración de dNTP y MgCl2, uso de adyuvantes (glicerol, DMSO, BSA), etc.

25. Grandes Deleciones Southern Blotting PCR Multiplex GAP-PCR MLPA Estrategias en el laboratorio de Biología Molecular

26. GAP-PCR. • Se utiliza un par de primers que flanqueen la zona delecionada (para el alelo mutado) y un primers ubicado sobre la deleción (para el alelo normal). • Se generará dos productos de amplificación, el fragmento de menor tamaño se producirá a partir del alelo que presenta la mutación.

27. Delecion African HPFH-2 M N

28. Grandes Deleciones Southern Blotting PCR Multiplex GAP-PCR MLPA Estrategias en el laboratorio de Biología Molecular

29. MLPA (múltiple amplificación de sondas dependiente de ligación) • Es una técnica basadas en una amplificación cuantitativa por PCR. • Presentan la ventaja de permitir el análisis de hasta 40-50 secuencias blanco simultáneamente. • Son técnicas muy usadas para detección de delecciones y duplicaciones del genoma. • Se aplica a estudios en genética humana, citogenética e investigación en cáncer

30. Instrumentos • Un termociclador y un sistema de electroforesis tipo de secuencia son requeridos para MLPA • Los resultados son obtenidos en 24 hs. • Mas de 96 Ms pueden ser procesados en un experimento

31. Mix-Probes • MLPA probes consiste de 2 oligonucleotidos: La sonda oligonucleotido izquierda(LPO) (7) y la sonda oligonucleotido derecha(RPO) (8)

32. Cada oligo a su vez contiene 2 partes: • El LPO contiene en su extremo 5’ el F y en su extremo 3’ La secuencia de la sonda de hibridización izquierda (LHS). • El RPO contiene en su extremo 5’ la sonda de hibridización derecha (RHS) y el primer R en su extremo 3’

33. Las sondas hibridizan de manera inmediatamente adyacente, de esta manera solo aquellos pares de sondas que encuentran sus secuencias blanco pueden ser ligadas y amplificadas por PCR.

35. Protocolo típico de MLPA

36. Característica General • La amplificación es de las sondas de MLPA, no de las muestra de ADN. • El pattern de los picos son generadas sobre la muestras de un paciente y una muestra de ADN de referencia. Se compara la altura relativa de los picos. Las diferencias reflejan los cambios en el número de copias detectados por las probes de MLPA. • Mas de 50 probes están presentes en una reacción de MLPA

37. VENTAJAS de MLPA: • Detección de número de copias de 40-50 secuencias de ADN genómicos en una simple reacción, basada en PCR • Requiere únicamente 20 ng de ADN humano (3.000 células/0,5 ml de fluido amniótico). • MLPA puede ser usado sobre Ms de ADN parcialmente degradadas tales como ADN extraído de tacos de tejidos parafinados.

38. PROBLEMAS de MLPA: • Costo • Necesidad de instrumental especifico

39. Deleciones

40. Alguna pregunta?