BIOLOGIA MOLECULAR Aula 6

1. PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA VETERINÁRIA DEPTO DE MEDICINA VETERINÁRIA PREVENTIVA BIOLOGIA MOLECULAR Aula 6

2. SÍNTESE E PROCESSAMENTO do RNA

3. Transcrição 5`ucuguaugucuaugucaaugucugaagcuaucu-3` DNA atgagagctagctagctagcatcgatcatgctagcatcgtagctagctagctacgtcgtagctacgtagc tactctgagatgctacgatcgatcgatcgatgctagcatcgtacgatgcatgcatgcatgcatgcatgcta Transcrito primario RNAm, RNAt, RNAr, snRNAs

4. Start point Terminador Promotor Regiãotranscrita Transcrição RNA ucuguaugucuaugucaaugucugaagcuaucu O GENE atgagagctagctagctagcatcgatcatgctagcatcgtagctagctagctacgtcgtagctacgtagc ……………………………………………………………………………………………………………………… tactctgagatgctacgatcgatcgatcgatgctagcatcgtacgatgcatgcatgcatgcatgcatgcta DNA

5. TRANSCRIÇÃO EM PROCARIOTAS

6. RNApolimerase • Complexo de subunidades • Sintetiza todos os RNAs • 7000 cópias/célula • Core + fator sigma = • Holoenzima (465 kDa)

7. Terminador Região transcrita Promoter O PROMOTER PROCARIOTA Iniciador atgagagctagctagctagcatcgatcatgctagcatcgtagctagctagctacgtcgtagctacgtagc ……………………………………………………………………………………………………………………… tactctgagatgctacgatcgatcgatcgatgctagcatcgtacgatgcatgcatgcatgcatgcatgcta PRIBNOW BOX TATA BOX

8. E.coli possui diferentes fatores SIGMA Função: reconhecimento dos diferentes promotores

9. Etapas da Transcrição INICIAÇÃO 1. Reconhecimento/ligação ao promotor 2. Separação das cadeias de DNA 3. Iniciação da polimerização 4. Elongação (polimerização) 5. Terminação

10. DNA é separado • (bolha de transcrição) • Velocidade: 40nt/seg • Movimento da RNA • Pol gera tensão adiante • E relaxamento atrás • - Girase/ topoisomerase • Corrigem estas distorções

12. Direção da síntese 5’ > 3’

13. TERMINAÇÃO • Dois modos: • Terminadores intrinsecos (+) • Terminators Rho-dependent (-)

14. A MAIORIA DOS mRNAs PROCARIOTAS SÃO POLICISTRÔNICOS CISTRON = GENE

15. RNA monocistrônico AUG STOP ORF 5’ 3’ Leader Tradução Trailer Proteína Em bactérias, são uma minoria!

16. RNA policistrônico Região Intergênica (-1 a 40nt) AUG AUG STOP STOP ORF-1 ORF-2 5’ 3’ Leader Tradução Tradução Trailer Proteína 1 Proteína 2 Em bactérias, são uma maioria! Geralmente codificam produtos c/ função relacionada

17. Transcrição e Tradução são simultâneos DEGRADAÇÃO ocorre CONCOMITANTE/ Meia-vida: seg-min

18. Degradação do mRNA Duas etapas - Clivagem (RNAse E) - Degradação terminal (exonuclease)

19. TRANSCRIÇÃO EM EUCARIOTAS

20. TRÊS RNA POLIMERASES (RNApol) - RNApol I - rRNA(nucléolo) - é a maisabundante - RNApol II - mRNA(nucleoplasma) - RNApol III – tRNA + snRNAs (nucleoplasma) (-) - Reconhecempromotoresdiferentes - RNApol I e II – geralmenteupstream - RNApol III – algunspromotoresdownstream • Necessitamváriosfatores de transcrição (TFs) • parainiciação (reconhecimento dos promotores)

21. RNApol II - Complexo enzimático (8 - 14 subunid.) > 500kDa • Possui atividade polimerase, mas é incapaz de reconhecer /ligar no promoter e iniciar a transcrição • Subunidade maior: contém a • cauda CTD (7 aa [YSPTSPS] 26 –50 • Fosforilação do CTD: regulação • do início da transcrição • Dois complexos enzimáticos: • - Iniciação; • - Elongação

22. PROMOTER BÁSICO • Existe em virtualmente todos os genes • Permite níveis basais de transcrição • Start point: Inr (geralmente Py2CAPy5)

23. A Maioria dos PROMOTORES EUCARIOTAS possuioutras sequênciasregulatórias

24. Iniciação da Transcrição

25. Formação do Complexo de iniciação • TFIID (TBP + TAFs) • TAFs: ~ 20 • RNApol: ~10 sub • Total: >1000kDa

26. Formação do Complexo de iniciação Complexo de iniciação

27. OUTRAS SEQUÊNCIAS REGULATÓRIAS - Locais de ligação dosTFs

28. PROMOTERS E ENHANCERS

29. PROMOTERS • Localizadospróximos (distânciafixa) do startpoint (<200nt) • Posição (distância) e orientaçãosãocríticos • Geralmenteupstream • São sítios de ligação de TFs • São essenciaisparatranscrição basal

30. ENHANCERS • Podemestarlonge (vários kb do startpoint) • Upstreamoudownstream • Posição e orientaçãonãosãocríticos • Sítios de ligação de TFs (< 100bp) • Aumentam a eficiência de transcrição a partir do Promoter • Nãosãoessenciaispara a transcrição basal

31. FATORES DE TRANSCRIÇÃO (TFs) General factors - são necessários para iniciação em todos os promoters. Formam com a RNApol II o complexo basal de transcrição. Upstream factors - reconhecem pequenas sequências (sítios)upstream. Atuam em qualquer promoter que tenha esses sítios, constitutivamente. Aumentam a eficiência da transcrição. Fatores induzíveis- Funcionam similar aos upstream, mas tem papel regulador. São ativados ou sintetizados em tecidos específicos ou em tempos específicos. São responsáveis pela regulação da expressão gênica no tempo e no espaço (diferentes tecidos).

33. COMO OS ENHANCERS EXERCEM FUNÇÃO NA TRANSCRIÇÃO À DISTÂNCIA???

36. Iniciação da Transcrição Complexo de iniciação

37. Início da transcrição • TFIIH possui atividades • ATPase, helicase, quinase • Fosforilação da CTD da • RNApol determina o • Início da transcrição • A fosforilação resulta na • Dissociação dos TFs - A maioria dos TFsé liberada antes do início Da transcrição

38. ELONGAÇÃO

39. 0-P 0-P 0-P CH2OH OH OH OH OH 3’ T A C C T 5’

40. Direção da síntese 5’ > 3’

41. Terminação • Mecanismo pouco conhecido • RNApolII passa do final • do gene • 3’ end é gerado por clivagem • Adição de poliA

42. Modificação do transcrito primário (em mRNA) • 5’ CAP • Clivagem 3’ • Splicing e exportação • Cauda poliAAAAAAA

44. 5’ CAP

45. Cauda poliA 5’-augcuagcuacgaucgaucgaucgaucgaucgcauAAAAAAAAAA(até 200) • Sintetizada logo após o fim da transcrição • Poly-A – polimerase • PolyAAA associa-se a PABP (múltiplas cópias) • Virtualmente todos os mRNA vindos do núcleo tem poliA • Função • Estabilidade para o RNAm (PABP) • Necessário p/ tradução (PABP tbém) • Necessário p/exportação (?) • Usos

47. A maioria dos genes eucariotas é descontínua

48. Exons e íntrons Média: 7 – 8 exons Exons: 100-200bp Introns: ~ 1-2kb Remoção dos Introns mRNASplicing

49. RNA catalítico: RIBOZIMA

50. PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA VETERINÁRIA DEPTO DE MEDICINA VETERINÁRIA PREVENTIVA BIOLOGIA MOLECULAR Aula 6