BIOLOGIA MOLECULAR Aula 7

1. PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA VETERINÁRIA DEPTO DE MEDICINA VETERINÁRIA PREVENTIVA BIOLOGIA MOLECULAR Aula 7

2. REPLICAÇÃO DO DNA

5. DNA polimerases: enzimas que sintetizam DNA • - Replicação do genoma: REPLICASES • - Outras: REPARO e funções auxiliares na replicação • - Procariotas: 3 DNA polimerases (DNA pol I, II, III) • Eucariotas: 5 polimerases (, ß, , ,  ) • Mas, apenas UMA é a replicase

6. PROPRIEDADES das DNA pol • - Sintetizam DNA a partir de moldes DNA • - Necessitam de PRIMER • - Mecanismo de síntese é similar • Síntese na direção 5’ > 3’ • Alta fidelidade • Atividade proofreading

7. Polimerização

8. Mecanismo de Polimerização

9. A REPLICAÇÃO É SEMI-CONSERVATIVA

11. A REPLICAÇÃO É BIDIRECIONAL

17. A REPLICAÇÃO É SEMI-DESCONTÍNUA

18. A Síntese de uma das cadeias é CONTÍNUA ...3’- ATGCTAGCTAGCTAGC 5’-UACGAUCGATCGATCG ATCGATAG ATCGATCGATCGATCG !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! TAGCTAGCTAGCTAGC TAGCTATC ...5’- TACGATCGATCGATCG LEADING strand

19. E A SÍNTESE DA OUTRA CADEIA????????

20. A direção da síntese é SEMPRE 5’ > 3’ ...3’- ATGCTAGCTAGCTAGC 5’-UACGAUCGATCGATCG ATCGATAG ATCGATCGATCGATCG !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! TAGCTAGCTAGCTAGC TAGCTATC ...5’- TACGATCGATCGATCG

21. A Síntese da outra cadeia é DESCONTÍNUA ...3’- ATGCTAGCTAGCTAGC 5’-UACGAUCGAUCGATCG ATCGATAG ATCGATCGATCGATCG !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! TAGCTAGCTAGCTAGC AUCGAUAC TAGCTATC ...5’- TACGATCGATCGATCG LAGGING strand

22. Síntese da LEADING strand ...3’- ATGCTAGCTAGCTAGC UACGAUCGAU ATCGATAG ATCGATCGATCGATCG !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! TAGCTAGCTAGCTAGC TAGCTATC ...5’- TACGATCGATCGATCG UMA ÚNICA INICIAÇÃO- PRIMER + ELONGAÇÃO

23. Síntese da LAGGING strand ...3’- ATGCTAGCTAGCTAGC ATCGATAG ATCGATAG ATCGTTTCGCGTCTATCTGCTGCTGCTCTTAT ATCTAG ATCGATCGAT !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! TAGCTAGCTA UAGCUAG TAGCTATC UAGCUAGC TAGCTATC TAGCTATC ...5’- TACGATCGATCGATCG • Vários eventos de INICIAÇÃO e ELONGAÇÃO • Remoção dos PRIMERs • Ligação das cadeias – Fragmentos de OKAZAKI

28. REPLICAÇÃO SEMIDESCONTÍNUA (O filme)

30. REPLICAÇÃO EM PROCARIOTAS

31. DNA POLIMERASES em E.coli • DNA pol I – REPARO (tbém auxiliar na Replicação) • DNA pol II - REPARO • DNA pol III – É A REPLICASE!!!! • Apenas a I e III são ESSENCIAIS

32. PROPRIEDADES DAS DNA pol de E.coli • I II III • Polimerização 5’>3’ + + + • Atividade exonuclease • 3’>5’ + + + • 5’>3’ + - - • Taxa de síntese por seg 600 , 30.000 • Moléculas por célula 400 , 10-20

33. “PROOFREADING” (3’ > 5’ EXONUCLEASE)

35. DNA pol I (E.coli) •  Primeira DNA pol caracterizada •  Polipeptídeo único: 104 kDa •  Clivagem gera dois produtos: 68kDa e 35 kDa •  Klenow fragment (68kDa): polimerase, exo 3’ > 5’ •  Fragmento de 35kDa: atividade 5’ > 3’ exonuclease •  Capaz de iniciar a síntese em “NICKs”(única) • Funções – -Reparo (Nick translation) -Termina a síntese da “lagging strand”

36. NICK TRANSLATION

38. DNA pol III (Replicase de E.coli) •  Complexo enzimático (várias subunidades) •  Atividade polimerase e 3’ > 5’ exonuclease •  Síntese da leading e laggingstrands • Fidelidade: 10-8 - 10-10 (1 erro/genoma/1000 ciclos) • Proofreading- aumenta fidelidade 10 a 200 vezes •  Síntese: 800 a 1000 nt/s

39. ETAPAS da REPLICAÇÃO 1. INICIAÇÃO Primossoma 2. ELONGAÇÃO Replissoma 3. TERMINAÇÃO/SEGREGAÇÃO

40. REPLICON: A UNIDADE DE REPLICAÇÃO  Inicia na ORIGEM - termina no TERminador  BACTÉRIAS: um ÚNICO REPLICON (4.000 kb)  REPLICAÇÃO: 46’  ORI: 245 bp  Contém 3 (13bp repeats), 4 (9bp repeats)  Sítios p/ ligação da proteína DnaA

42. ORIgem em E.coli -245 bp • Três 13mer repeats • Quatro 9mer repeats

43. Pré-INICIAÇÃO em E.coli • DnaA liga-se nos 9mer • Multimerização da DnaA • Forma agregados e flexionam • O DNA • Separação das cadeias • Inicia nos 13mers • DnaB+DnaC juntam-se • Ao complexo e formam o • Complexo de iniciação • DnaB – helicase • DnaC- liga-se na DnaB

45. FUNÇÕES NO REPLICATION FORK Função E.coli HelicaseDnaB PrimaseDnaG Clampsubunit Catálise Pol III Remoção do Primer E substituição por DNA Pol I Ligação dos OkazakiLigase

46. Helicase Primase DNApol III SSB DNApol I

49. REPLICAÇÃO EM EUCARIOTAS

50. EUCARIOTAS  Múltiplos REPLICONS  YEAST (40kb), mamíferos (100kb)  ORI? Terminador?  Iniciam na fase S  Síntese (2000bp/min x 50.000/min em E.coli)  Síntese não é simultânea  Replicação completa em 6 horas