第 19 章色谱分析法引论 An Introduction to Chromatography

第19章色谱分析法引论An Introduction to Chromatography 分析化学

1903/1906年 迈克尔·茨维特(Michael Tswett) 华沙大学俄国的植物学家植物的石油醚提取液在碳酸钙吸附剂填充的玻璃管中分离出叶绿素及其他色素

(1）粗叶绿素+石油醚（2）石油醚 流动相相对运动固定相（吸附剂）CaCO3 胡萝卜素利用不同物质叶黄素在流动相与固定相叶绿素作用时的行为差异得到分离(吸附) （3）小刀割开，用醇溶出（吸附作用）

1931年库恩奥地利化学家 胡萝卜素植物色素分离 20世纪30年代离子交换色谱建立 1940年吸附色谱与电泳相结合 1941年分配色谱创立 1952年气相色谱法建立 1968年高效液相色谱法建立 1975年之后离子色谱、超临界流体色谱、高效毛细管电泳、场流动分级分离

Tiselius, A.W.K. Martin, A.J.P. Synge, R.L.M.1948年 Nobel 化学奖 1952年 Nobel 化学奖吸附色谱与电泳分配色谱

第19章色谱分析法引论 19 —1 概要及术语 19 —2 色谱过程的讨论（理论）塔板理论速率理论总分离效能指标 19 —3 色谱的定性定量

第19章色谱分析法引论 19 -1 概要及术语 1、分类气体 (气相色谱） GC 液体 (液相色谱）LC 超临界流体（超临界流体色谱）SFC 流动相液液固固固固定相吸附剂吸附剂键合键合多孔交换固定相外形柱柱柱平面平面柱柱柱柱柱键合相色谱尺寸排阻色谱离子交换色谱超临界流体色谱气液色谱气固色谱液液色谱薄层或纸色谱液固色谱名称

第19章色谱分析法引论 19 -1 概要及术语 2、平面色谱薄层色谱 0.25mm 厚纤维素，硅胶玻板纸色谱滤纸液-液萃取为原理组份在两相中反复分配因毛细作用而上升溶剂溶质在水相中各种存在形式总浓度分配比 k =c水/c有溶质在有机相中各种存在形式总浓度

第19章色谱分析法引论 19 -1 概要及术语 2、平面色谱固定相滤纸（巳吸水20%）流动相上升前沿比移值Rf1=Zx1 / Z Z x2Rf2=Zx2 / Z Zx2图中kx2小→快→Rf2大 x1kx1大→慢→Rf1小分开 Zx1斑点位置 Rf 值定性斑点用荧光、光度积分值定量展开剂（有机溶剂）流动相

第19章色谱分析法引论 19 -1 概要及术语 3、柱色谱（1）以GLC为例Gas 流动相高沸点有机化合物（固定液）固定相化学隋性固体微粒（担体）溶解挥发现代柱色谱后加 Gas带 A 检测器组分A L可记录到柱后组分浓度转换成的电信号强度

第19章色谱分析法引论 19 -1 概要及术语3、柱色谱（2）色谱图随时间 t 记录色谱流出曲线，即色谱图 ItR Wσ t0 tR′ h W½h/2 0.607h o Wb t 进样空气组分1 组分2 （惰性物质）

第19章色谱分析法引论 19 -1 概要及术语3、柱色谱（3）术语基线 ot 死时间 t0 柱出口处流动相的体积流速死体积 V0=t0·F0通常用校正体积流速保留时间 tR（即柱温和大气压的载气流速）保留体积 VR=tR·F0 校正保留体积 VR0=tR·FC 调整保留时间 tR′=tR–t0 柱内平均体积流速调整保留体积 VR′=VR–V0 = tR′· F0 净保留体积 VR0 ′=tR ′·FC

第19章色谱分析法引论 19 -1 概要及术语3、柱色谱（3）术语柱内平均体积流速 FC ? 可用皂膜流量计在柱后测得流速F（视体积流速）进行饱和水蒸气压校正 P0 - PW / P0 柱温校正 Tc / Tr 压力校正因子 j=(3 /2 ) ·[(Pi/P0)2-1] / [(Pi/P0)3-1] F ′室温和大气压力下载气流速 FC = F·（P0 - PW / P0）·（ Tc / Tr ）· j F0 柱温和大气压力下载气流速

对分配色谱：分配系数kd 第19章色谱分析法引论 19 -1 概要及术语3、柱色谱（3）术语 kd= Cs/Cm Cs-单位体积固定相中组分的质量 Cm-单位体积流动相中组分的质量对吸附色谱吸附平衡常数ka ka= Cs/Cm Cs-每克固定相中吸附组分的质量 Cm-每毫升流动相中组分的质量

分配容量（容量因子，分配比） 第19章色谱分析法引论 19 -1 概要及术语3、柱色谱（3）术语 k`=ns/nm=(CsVs)/(CmVm)=kVs/Vm=k/ ns, nm----分别为组分在固定相和流动相中的量； Vs，Vm----分别为固定相和流动相的体积； ----相比

第19章色谱分析法引论 19 -1 概要及术语3、柱色谱（3）术语色谱峰宽（区域宽度）半峰宽度 W1/2 = 2σ√2ln2 =2.354 σ 峰底宽 Wb = 4σ 拐点处峰宽 Wσ = 2σ

第19章色谱分析法引论 19 -1 概要及术语3、柱色谱（4）色谱图的信息 a. 色谱峰个数判断试样中所含组分的最少数 b. 色谱保留值定性 c. 色谱峰面积或峰高定量 A = K C d. 保留值与区域宽度评价柱分离效能依据 e. 两峰间距评价两组分能否分离

第19章色谱分析法引论 19 -1 概要及术语3、柱色谱（4）色谱图的信息上面色谱图由实验得到，是实验事实但（1）为什么出这样的峰？为什么不是其它形状？色谱过程到底如何？（2）获得色谱图的具体装置？怎样才能获取最好的色谱信号？（3）如何解释图、具体如何定性？定量？有何特点。

第19章色谱分析法引论 19 –2 色谱过程的讨论（理论） 1 塔板理论（以气液分配色谱作说明）（1）设想 Martin 比拟为蒸馏塔 0 1 2 3 4 5 6 ······· 气相G H 体积ΔV 载气液相L 一个塔板、板高H

第19章色谱分析法引论 19 –2 色谱过程的讨论（理论） 1 塔板理论（2）假定 a. 每一塔板内、组份迅速达到平衡。 b. 载气间歇进入，每一次为一个塔板体积。 c. 载气不可压缩。 d. 一开始组份都在 0 号塔板上，沿柱长方向扩散不考虑。 e. 组份的分配系数K = CL/ CG，在每个塔板上是常数。

第19章色谱分析法引论 19 –2 色谱过程的讨论（理论） 1 塔板理论（3）色谱气过程的分解动作分配比 k=p/q （组份在液相中重量 / 组份在气相中重量）对混合组份 A ,B 若 kA=1 即 A 组份在平衡时，气液中各一半量 kB= 0即 B 组份在平衡时，液相中不溶解进样初始态 A+B 加入载气体积数 N=0

第19章色谱分析法引论 19 –2 色谱过程的讨论（理论） 1 塔板理论（3）色谱气过程的分解动作进样初始态 A+B r=0 1 2 3 4 5 ···· n 加入载气体积数 N=0 平衡时 N=1 ΔV1 N=2 ΔV2 N=3 ΔV3 N=4 ΔV4 ···· N=n ΔVn A B B A

第19章色谱分析法引论 19 –2 色谱过程的讨论（理论） 1 塔板理论（3）色谱气过程的分解动作上图中的分布是一个二项式分布，可用二项式展开计算。当N 或 n很大时，用数理统计，正态分布，概率分布函数给出表达式n， n为塔板数。

第19章色谱分析法引论 19 –2 色谱过程的讨论（理论） 1 塔板理论（4）表达式柱效能概念上图可见，对于同一柱长L，若塔板数n ↑ 即 H↓ ,则平衡分配次数愈多 . 说明该物质在这个柱上的效能愈大 n 可衡量一根柱的效能,n 愈大，被分离的可能愈大 n理论=16(tR/Wb)2=5.545 (tR/ W1/2)2 H理论= L/n理论 n表示一定条件下，柱分离能力发挥程度的标志。由于tR中含有t0,,实际在分配中发挥作用仅是tR中的tR′部分 n有效=16(tR ′/ Wb)2=5.545 (tR ′/ W1/2)2 H有效= L/n有效

第19章色谱分析法引论 19 –2 色谱过程的讨论（理论） 1 塔板理论（5）关于塔板数计算的几个问题 a. n 是人为概念，不同方法测得的塔板数相差很大，但它有用为比较相似色谱柱或制备柱时的技术好坏建立了标准 b. n不仅决定于组分及两相的性质，还与一系列操作条件有关因此比较柱效能时，必须指定组份、固定相及含量、柱温、流动相及速度、进样量等。 c. 不同组份在同一柱上，k值大的，n值较大。 d. 不对称色谱峰，计算会产生较大误差，可达到10—20%，峰愈近正态分布，误差愈小。 e. 检测器响应与浓度应有线性响应，否则n值不真实。 f. 计算n时，保留值与峰宽应有相同单位。

第19章色谱分析法引论 19 –2 色谱过程的讨论（理论） 1 塔板理论（6）对塔板理论评价成功： a. 解释色谱流出曲线形状（呈正态分布） b. 浓度极大点位置 c. 评价柱效应能高低的塔板数计算存在问题：a. 不能说明板高的影响因素 b. 色谱宽变宽原因 c. 不能解释不同流速的 n 值不同假定与实际不相符引起

第19章色谱分析法引论 19 –2 色谱过程的讨论（理论）2 速率理论（1）范第姆特公式 1956年荷兰范·第姆特(Van Deemter)公式: H = A + B /u + Cu 概括了影响 H 的动力学效应

第19章色谱分析法引论 19 –2 色谱过程的讨论（理论） 2 速率理论（1）范第姆特公式 A项——涡流扩散项即多径项 t1 t0 t1≠t1′峰变宽 t1′ A = 2λdP 不规则因子颗粒平均直径表示不均性填充物不规则性，使路径不同对空心柱 A = 0要使H小怎么办？

第19章色谱分析法引论 19 –2 色谱过程的讨论（理论）2 速率理论（1）范第姆特公式 B/u项——分子扩散项即纵向扩散试样‘塞’ 向两边（纵向）扩散要使H小怎么办？ GC 中此项不计 B = Bm + Bs = 2γmDm +γsDs k 流动相固定相弯曲因子扩散系数分配比 γ＜1Dm :0.01～1cm2/ss 扩散时的路径弯曲即扩散受阻系数Ds:10-4～10-5Dm 要B↓ 对一定柱Dm ↓( 组份分子量↑ 柱温↓ 柱压↑ 载气分子量↑) 要u↑ 即停留时间短注意:λ与γ是有区别的, 填充物均匀λ↓,而γ不一定↓

第19章色谱分析法引论 19 –2 色谱过程的讨论（理论）2 速率理论（1）范第姆特公式 Cu项—传质阻力项传质过程指什么？浓度不均匀而发生的质量迁移过程表现为两相中的扩散过程及溶解、平衡、转移过程 G—L例：组分在气相任一部位移动速度由气相转质阻力系数表示 G移至界面 C = Cm + Cs L移至移动速度由液相转质阻力系数表示组分在液相中任一部位

第19章色谱分析法引论 19 –2 色谱过程的讨论（理论）2 速率理论（1）范第姆特公式 Cu项—传质阻力项传质阻力使峰变宽组分在气相中浓度 CG 柱距离组分在液相中浓度 CL 理想状态瞬间平衡实际情况有CL=KCG气相在运动平衡需要时间平衡常数若K=1（传质阻力存在）则柱x 距离有等浓度 A点： CL＜KCG B点： CL＞KCG

第19章色谱分析法引论 19 –2 色谱过程的讨论（理论）2 速率理论（1）范第姆特公式 Cu项—传质阻力项C= Cs+ Cm 构成因子固定相液膜厚度分配比与容量因子有关的系数 GLC LLC Csq·k ds2ωs·ds2 固定相 (1＋k）2 DsDs Cm 0.01·k2dp2 (ωm+ωsm) ·dp2 流动相（1＋k）2 DmDm 流动相因流动对在微孔中滞留流动相传质阻力的贡献对传质阻力的贡献

第19章色谱分析法引论 19 –2 色谱过程的讨论（理论）2 速率理论（1）范第姆特公式 Cu项—传质阻力项 ωs 固定相因流动对传质阻力的贡献 ωm 流动相因流动对传质阻力的贡献 ωsm 在微孔中滞留流动相对传质阻力的贡献

第19章色谱分析法引论 19 –2 色谱过程的讨论（理论）2 速率理论（1）范第姆特公式小结 H = H A +H B + H C= A + B /u + Cu

第19章色谱分析法引论 19 –2 色谱过程的讨论（理论）2 速率理论（2）范氏方程的发展 GL中： 1962年吉丁斯（Giddings）“涡流扩散耦合理论 ” 展宽因素相互影响、不是简单加和、流动方式极为复杂 A项修正为与气相传质相互作用有关 A=[(1/ 2λdP)+(1/ Cm u)]-1

第19章色谱分析法引论 19 –2 色谱过程的讨论（理论）2 速率理论（2）范氏方程的发展 LL 中：范氏方程可进一步简化当dP足够小时，2λdP与ωm·dp2/Dm合并，近似表达为Au 0.33 H = Au 0.33 + B /u +（ Cs+ Cm ）u 填充良好，粒径较大多孔膜ds很小时，HPLC中纵向扩散很小 H = Au 0.33 +Cm u

第19章色谱分析法引论 19 –2 色谱过程的讨论（理论）2 速率理论（3）成功之处解释影响板高因素填充均匀度颗粒大小流动相流速类型固定相厚度对选择操作条件具有指导意义

第19章色谱分析法引论 10 –2 色谱过程的讨论（理论）3 柱的总分离效能指标（1）n作为柱效能指标即反映物质在柱中达到分配平衡次数但不能直接反映难分离物质对A、B的分离效果

第19章色谱分析法引论 19 –2 色谱过程的讨论（理论）3 柱的总分离效能指标（2）分离度R 即总分离效能指标 R=2·(tR2-tR1)/(Wb1+Wb2) 浓度[A]/[B]=1/1时 R=1 分离程度 98% R=1.5 分离程度99.9% 完全分离相邻两峰Wb1+Wb2= 8σ R= (tR2-tR1)/ 4σ

第19章色谱分析法引论 19 –2 色谱过程的讨论（理论）3 柱的总分离效能指标（3）色谱分离方程式（R、k、n三者关系）令 Wb1+Wb2= 2W R= (tR2-tR1)/W= (tR2′-tR1 ′)/W 即 W= (tR2-tR1)/ R= (tR2′-tR1 ′)/R 又∵ n有效=16(tR2′/ W2)2 或n理论=16(tR2/W2)2 即有 n有效=16[R· tR2′/ (tR2′-tR1 ′)]2 =16R2(γ2,1 / γ2,1 –1)2 R=(√n有效 /4)[(γ2,1 –1)/γ2,1]

第19章色谱分析法引论 19 –2 色谱过程的讨论（理论） 3 柱的总分离效能指标（3）色谱分离方程式 R=(√n有效 /4)[(γ2,1 –1)/γ2,1] 或 n理论=16(tR2/W2)2 n理论=16[R· tR2 / (tR2-tR1)]2 =16R2 {（tR2 / tR1) /[（tR2 / tR1)-1]} 2 ∵ tR= t0（1+k) ∴（tR2 / tR1) = （1+k 2) / （1+k 1) 即有R=(√n理论/4) {[(tR2 / tR1)-1]/（tR2 / tR1)} R=(√n理论/4) [(k2-k1) /（1+k 2)] 定义: k2/k1 =α 分离系数（选择性系数） γ2,1 =k2/k1 =tR2′/tR1 ′（相对保留值） R=(√n理论/4) [(α-1) / α ] ·[k2/（1+k 2)] 色谱分离基本方程式 k2＞20 [k2/(1+k2)]=1 n有效=n理论

第19章色谱分析法引论 19 –2 色谱过程的讨论（理论）3 柱的总分离效能指标（4）讨论 R是容量因子k2 分离系数α （即相对保留值γ2,1 ）柱效能 n 函数

第19章色谱分析法引论 19 –2 色谱过程的讨论（理论）3 柱的总分离效能指标（4）讨论提高R的方法: A.使k↑ 则k2/(1+k 2) ↑ R ↑ 太大 a.延长分析时间 b.造成检测困难 K 一般在 2~7 k＞10分离度提高不明显 k＜2淋洗时间会出现极小值 B.使n↑则R↑。分离改善、峰变窄有利提高分析灵敏度但增加柱长使n↑, 延长分析时间。设法使H↓，才是增加R ↑的最好办法

第19章色谱分析法引论 19 –2 色谱过程的讨论（理论）3 柱的总分离效能指标（4）讨论提高R的方法: C.使α↑ 则（α–1）/α↑ R ↑ α ＞2 时短时间内组分会完全分离 α接近1 时延长时间才能完全分离 (α=1.01分离时间是α=1.1时的84倍) α =1时无法分离 α一定，R正比于n有效,即分离度直接与n有效有关说明n有效更能正确地代表柱效能。

第19章色谱分析法引论 17 –3 色谱的定性定量 1. 色谱的定性对照利用保留值进行定性（1）用纯物质的保留值进行对照（2）用相对保留值r进行对照 r1,2= tR1′/tR2′= VR1′/VR2′= k1/k2 = K1/K2 ●1 组份，2 纯物质 ● r 值可以是文献的或测定的（3）用保留指数 I（Kováts指数）进行定性 Ix={(logZx-logZN)/ (logZN+1-logZN)} ×100＋100N ●N+1,N 相邻的正构烷烃 ● 与文献对照，不需要纯物质

第19章色谱分析法引论 19 –3 色谱的定性定量 2 色谱的定量（1）定量关系式 W =f·A A = S·W W - 被测物质的量 f - 定量校正因子 S - 检测器的响应灵敏度

第19章色谱分析法引论 19 –3 色谱的定性定量 2 色谱的定量（2）相对校正因子f 或相对灵敏度S 的测定 fi（m）=f’i（m）/f’s（m）=As· mi/（ A i· ms ） fi（M）=f’i（M）/f’s（M） =As· mi· Ms/( A i· ms · Mi）= fi（m） (Ms/Mi） fi（V）=f’i（V）/f’s（V） =As· mi· Ms · 22.4/( A i· ms · Mi · 22.4）= fi（M） Si =1/fi

第19章色谱分析法引论 19 –3 色谱的定性定量 2 色谱的定量（3）峰高及峰面积测量 a.手工几何法对称峰A =1.065 h·W1/2 不对称 A =h (W 0.15+W 0.85)/2 重叠峰（分割）称重 b.仪器测量电子积分仪微电脑积分

第19章色谱分析法引论 19 –3 色谱的定性定量 2 色谱的定量（4）定量校正方法 a. 外标法 b. 内标法（内标物？） c. 归一化法 Xi（%）=(Ai /∑Ai) ×100 × Xi（%）=(Wi /∑Wi) ×100 =(fi·Ai /∑fi ·Ai) ×100 √ 增量法可用吗？如何用？

《色谱分析法导论》 结束

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