Клеточные технологии в гематологии

1. Клеточные технологии в гематологии Академик РАМН, профессор А.Г.Румянцев профессор С.А.Румянцев ФГБУ Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Дмитрия Рогачева

2. Эпибласт-подобная плюрипотентная СК Плюрипотентные СК Мезодермальная СК Эндодермальная СК Тканевые СК Гемангиобласт Кожные СК Невральные СК Гемопоэтические СК Сосудистые СК Мезенхимальные СК Печеночные СК Панкреатические СК Кишечные СК Остеобласт Хондробласт Миобласт Кардиомиобласт Пре-адипоцит Фибробласт Лимфоидные клетки-предшественники Миелоидные клетки-предшественники Эндотелиальные клетки-предшественники Эпителиальные клетки Меланоциты Волосяные фолликулы Нейроны Астроциты Т-лимфоциты В-лимфоциты NK клетки Гранулоциты Моноциты Эритроциты Тромбоциты Дендритические клетки Эндотелиальные клетки Гепатоцит Островковая клетка Кишечные клетки Олигодендроциты Остеоцит Хондроцит Миоцит Кардиомиоцит Адипоцит Фибробласт Гладкомышечная клетка Перициты Экзодермальная СК

4. Ex vivo экспансия Генная терапия Костный мозг Пролиферация Дифференцировка Цитокины Ростовые факторы Гормоны Фармацевтика Мобилизация In vivo экспансия Циркуляция Периферическая кровь Пополнение Органы Сверхэкспрессия ангиогенных ростовых факторов

6. Источники стволовых клеток • Костный мозг • Периферическая кровь • Пуповинная кровь

7. Действие Г-КСФ на стволовые клеткиреализуется через связь со специфическим рецептором

8. Плотность рецепторов к Г-КСФ на клетках миелоидного ряда нейтрофил CD-34+ КОЕ-ГМ моноцит Плотность рецепторов к Г-КСФ

9. нейтрофил моноцит IL-8 IL-8 MMP-9 Г-КСФ Кровь G2/S G0 К.М.

10. Г-КСФ IL-8 IL-8 G0 MMP-9 Кровь G2/S К.М.

11. Концепция мобилизации ГСК • Основной мишенью для действия Г-КСФ являются зрелые нейтрофилы, инициирующие каскад событий, приводящих к мобилизации CD34+ клеток; • Возрастание числа CD34+ клеток в циркуляции под действием Г-КСФ происходит в результате повышения миграции, а не вследствие усиления их пролиферации; • Прогноз эффективности мобилизации CD34+ клеток под действием Г-КСФ зависит от числа нейтрофилов в периферической крови.

12. Трансплантация стволовых клеток костного мозга и периферической крови

13. 1992-2011 гг.У 590 пациентов проведено 679ТГСКвозраст: 1 мес.-18 лет (медиана 10 лет)

14. Виды ТГСК1 - от HLA-идентичных родственных доноров2 - неродственные3 - аутологичные4 - гаплоидентичные

15. ИСТОЧНИКИГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ КЛЕТОК

16. НОЗОЛОГИЧЕСКИЕ ФОРМЫ

17. 61,6%±7,8 55,2%±7,5 43,3%±9,1 7,14%±6,2 р=0,0055

18. 20 лет терапии ОЛЛ в РоссииEvent-Free Survival

19. 62,1%±9,6 35,6%±10,6 р=0,355

20. 92,9%±6,8 80,3%±4,6 р=0,19

21. n=13 84,0%±10

22. (ПИД) 73,3%±13,2 38,7%±15,1 38,4%±13,5 р=0,64

23. Трансплантация от неродственного совместимого донора у детей: опыт ФНКЦ ДГОИ/РДКБ 1997 – 2010 год 146 пациентов 160 трансплантаций Медиана возраста 7,9 лет (0,5-18,7) М:Ж 98:48

25. Статус злокачественного заболевания на момент трансплантации Трансплантат Профилактика РТПХ Кондиционирование

26. Ранние исходы во всей группе • Смерть до приживления – 2% • Первичное приживление – 97% • Медиана приживления - 17 дней (7-40) • Смертность (100 дней) – 5% • Рецидивы (злокачественные заболевания) • 18 (18%) • TRM (все) – 48 (33%)

35. РТПХ оРТПХ 1-4 ст – 63% оРТПХ 2-4 ст – 42% оРТПХ 3-4 ст – 15% хрРТПХ - 39% хрРТПХ персистирует – 24%

36. Трансплантации от альтернативного донора: за и против Гаплоидентичная трансплантация: новые технологии в клинике Новые методы Т-деплеции : иммуномагнитная CD34+ селекция Иммуномагнитная CD3+/CD19+ деплеция Чистота продукта – 98% Потери ~ 20% Деплеция Т-лимфоцитов – 4.2 log Деплеция B-лимфоцитов – 3.5log 2006 – 1 2007 – 2 2008 - 15 2009 – 2 2010 – 2011 – 2012 – 9

37. Опыт клинического применения МСК в ФГУ ФНКЦ ДГОИ (2008-2010 г.) Методика экспансии МСК оформлена в виде «новой медицинской технологии» и зарегистрирована Медицинская технология «Экспансия exvivo мезенхимальных стволовых клеток» от 09 августа 2007 г. № ФС-2007/176, выданная Федеральной службой по надзору в сфере здравоохранения и социального развития. МСК применялись: • у 26 пациентов с РТПХ в дозе 2-4 млн клеток на кг веса 2-4 кратно. • для ускорения приживления трансплантата у 16 пациентов в дозе 1-3 млн клеток на кг веса однократно за 2-4 часа до трансплантации кроветворных стволовых клеток. • Выращивали МСК костного мозга пациентов используя стандартную методику клоногенного культивирования стромальных фибробластов костного мозга. • Культивирование проводили до 2-3 пассажа. • Катамнез после проведения аллогенной трансплантации (сроки наблюдения от +26 дня до +302 дня)

38. Используемый в нашей работе протокол культивирования МСК позволяет получить достаточное для клинического применения количество клеток. Клеточные препараты МСК не вызывали ранних трансфузионных осложнений при применении у пациентов с гематологическими и онкогематологическими заболеваниями. Предложенный метод ex vivo экспансии МСК костного мозга может быть рекомендован для применения в клинических целях. При использовании в терапевтических целях МСК необходим строгий контроль поверхностного фенотипа и генетической стабильности клеточных трансплантатов что позволит в будущем избежать нежелательных отдаленных последствий использования культур МСК.

39. В ФГУ ФНКЦ ДГОИ разработана технология и проведена экспансия NK-клеток для клинического использования (18 образцов). Методика оформлена как новая медицинская технология. • Использование NK-клеток в дозах 5-10 млн на кг веса тела позволяет рассчитывать на улучшение исхода у пациентов с остаточными опухолями и после проведения трансплантации. • Актуальность их применения растет с каждым годом в связи с широким применением трансплантаций гемопоэтических стволовых клеток, как одного из способов лечения ряда гематологических и онкологических заболеваний. • NK-клетки - цитотоксические лимфоциты, обеспечивают эффект «трансплантат против опухоли» , не вызывают РТПХ. фенотип: CD3-, CD16+,CD56+,CD94+. • NK-клетки могут быть применены для иммунотерапии пациентов, клетки которых экспрессируют иные молекулы MHC класса I, что особенно актуально при гаплоидентичной трансплантации. Материал - продукта афереза, либо продукт селекции CD56+ клеток из афереза периферической крови донора 10-50х106 клеток. Способы культивирования — закрытая система (пластиковые мешки для культивирования), открытая система (флаконы). Сроки экспансии– 14-20 дней.Результат - более чем 200-кратная экспансия CD56+ клеток

40. Экспансия дендритных клеток для приготовления противоопухолевых вакцин Опыт ФГБУ ФНКЦ ДГОИ: • Создана персонифицированная технология лечения онкологических заболеваний. • Отработаны методы индукции созревания и активации дендритных клеток с высоким уровнем антигенпрезентирующего потенциала при культивировании in vitro с ростовыми факторами и опухолевым лизатом. • Разработаны методы оценки противоопухолевого ответа у вакцинированных больных. • Создан банк хранения опухолевого материала.

41. Технология ex vivo экспансии лимфокин-активированных лимфоцитов • Лимфокин-активированные киллеры (ЛАК) представляют собой генерируемые из мононуклеарных лейкоцитов при инкубации с интерлейкином-2 (ИЛ-2) активированные лимфоциты. • ЛАК, характеризуются высокой НК-активностью и обладают цитотоксическим действием по отношению к аутологичным и аллогенным опухолевым клеткам. • Подобно натуральным киллерам (НК), оказывают избирательное действие на трансформированные клетки, вызывая лизис опухолевых клеток-мишеней, и не влияют на нормальные клетки организма. Антиген-специфическая Т-клеточная терапия применяется при лечении: • Гемобластозов (ОМЛ,ОЛЛ,ХМЛ, НХЛ) • Солидных опухолей (рабдомиосаркома, опухоль Вильмса и др.) • Лечение осложнений после проведения высокодозной химиотерапии и ТКМ (ЭБВ- лимфопролиферативные заболевания)

42. Банки пуповинной крови 1993 год - New York, Milan, Dűsseldorf 2003 год - Bone Marrow Donor Worldwide (33 банка ПК из 21 страны) 2003 год – открытие БСК ДЗ г.Москвы 2005 год – открытие Центра крови в г. Самаре На публичном хранении 6656 образцов, 42 выдано для трансплантации (из них 12 за рубеж), 1550 на персональном хранении

43. Особенности кроветворения новорожденного ребенка Высокая проницаемость Особенности костномозгового барьера иммунитета Мобилизующий эффект цитокинов, запускающих роды Большое количество коммитированных (в основном за счет CFU-GM и CFU-GEMM) и более ранних клеток-предшественников, обладающих высокой пролиферативной активностью.

44. CD34+клетки Состав пуповинной крови (n=1004) Количество CD34+клеток в ПК доношенных новорожденных n = 612 CD34+клетки (%) – 0,827 CD34+клетки (10³/мм³) - 103 Спектр гемопоэтических клеток-предшественников пуповинной кровиn = 226 Колониеобразующую активность лейкоцитарной фракции ПК определяли при культивировании в течение 14 суток в метилцеллюлозе (готовая среда, содержащая факторы роста «MethoCult 4338, StemCellTehnologies, Canada) с подсчетом количества КОЕ-mix, КОЕ-ГМ, КОЕ-Г, КОЕ-М, КОЕ-Э.

45. Влияние родового стресса на выраженность мобилизации ПК Пол новорожденного Масса тела новорожденного Способ родоразрешения Острая гипоксия плода

46. Процессинг в банке ПК МЕТОД УМЕНЬШЕНИЯ ОБЪЕМА до 25 ml • Усиление осаждения RBC с применением HES • Центрифугирование и удаление избытка эритроцитов и плазмы для получения 20 мл концентрата WBC • Криопротектант с конечной концентрацией 0.8 % HES, 1 % Dextran 40, 10 % DMSO в окончательном объеме 25 мл

47. Миграция клеток крови между циркуляцией матери и плода

48. Миграция клеток крови между циркуляцией матери и плода Частота детоматеринских трансфузий 50% беременностей Частота массивных детоматеринских 0,5 - 1% беременностей трансфузий, вызывающих анемию или полицитемию Трансплацентарный пассаж эритроцитов - хроническая костно-мозговая аплазия или трансиммунная ГА Трансплацентарный пассаж лейкоцитов и тромбоцитов - нейтропения и тромбоцитопения новорожденных

49. Доказательства межклеточных взаимодействий в системе мать-плод • При всех беременностях человека клетки плода встраиваются в циркуляцию матери • Клетки плода обнаруживаются на 6 неделе гестации и частота их обнаружения нарастает с ростом гестационного возраста, достигая 100% к 36 неделе гестации • При нормальной беременности во втором триместре беременности число клеток плода в венозной крови матери составляет 1-6 клеток/мл (т.е., от 5 до 30х103 клеток) • При аномалиях плаценты и плода, эклампсии, проблемах тканевой совместимости, невынашивании, самопроизвольных абортах в сроки от 20и недель, число циркулирующих клеток плода возрастает до 20-1500 клеток в мл. • После родов количество клеток плода в циркуляции резко снижается, но 50% фетальных клеток обнаруживаются в крови от 4 недель до 10 недель после родов • Специальные исследования послеродового микрохимеризма обнаруживают его у 40% здоровых женщин, перенесших беременность

50. Определение фетальной ДНК и РНК в материнской плазме