Objetivo : Conocer las técnicas básicas para el análisis de fertilidad microbiana del suelo

1. PRÁCTICO N° 3 Análisis de fertilidad de los suelos Objetivo: Conocer las técnicas básicas para el análisis de fertilidad microbiana del suelo • Técnicas mas utilizadas • Abundancia de microorganismos • Biomasa total • Determinación de grupos funcionales (fijadores de nitrógeno, celulolíticos, nitrificadores, amonificadores, etc.) • Actividad microbiana • Heterótrofa total (producción de CO2, consumo de O2) • Enzimas especificas( nitrogenasa, sacarosa, ureasa, amilasa)

2. Técnicas para determinar abundancia de microorganismos • Recuento de células totales • Método directo (visualización al microscopio, "camara de recuento") • Método por turbidez (Fotómetro)

3. Recuento de células viables • En medios sólidos: formación de colonias en caja de Petri (UFC) Rango entre 30 – 300 colonias • En medios líquidos: número mas probable (NMP) Detección del crecimiento por consumo de sustrato o formación de productos

4. Recuento de células viables: grupos funcionales Grupo funcional: microorganismos que tienen procesos metabólicos semejantes, independientemente de su taxonomía • Procedimiento para determinar abundancia de grupos funcionales • 1) Suspensión y dilución de suelo • 2) Siembra en medios selectivos • 3) Determinación del crecimiento (lectura) • 4) Cálculo de abundancia

5. Análisis de grupos funcionales 2- Diluciones decimales 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1- Suspensión X g suelo 9 ml H2O destilada por tubo + X ml H2O destilada 10° Agitar 3 minutos 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 Recuento en medio sólido Recuento en medio líquido (Ca jas Petri) (NMP) 3- Siembra de cada grupo funcional Organismos fijadores de N Nitrificadores Celulolíticos Amonificadores 4- Incubación y crecimiento ESTUFA 5- Lectura y cálculos LECTURA

6. Suspensión de suelo Material de trabajo Agregar 1 g de suelo en 100 ml de H2O destilada Tapar y agitar durante tres minutos Suspensión de suelo

7. Preparación de las diluciones Flamear un porta-pipeta Extraer una pipeta estéril Extraer 1ml de la suspensión de suelo

8. Preparación de las diluciones Poner el ml en el tubo 10-1 Mezclar y extraer 1 ml Poner el ml en el tubo 10-2 Continuar igual con todos los tubos

9. 1 2 3 4 5 6 7 8 0 Siembra en medios específicos: Amonificadores Diluciones: -8, -7, -6 Siembrar en medio con asparagina Incubación 28-30°C, 7días

10. 1 2 3 4 5 6 7 8 0 Siembra en medios selectivos: Celulolíticos Diluciones: -5,-4,-3 Sembrar en medio líquido con papel de filtro Incubación 28-30°C, 15 días

11. 1 2 3 4 5 6 7 8 0 Siembra en medios selectivos: Fijadores Dilución: -3 Sembrar en medio sólido sin N Incubación 28-30°C, 5 días

12. 1 2 3 4 5 6 7 8 0 Siembra en medios selectivos: Nitrificadores Dilución: -3,-2,-1 Sembrar en medio líquido con sulfato de amonio Incubación 28-30°C, 21 días

13. Siembra de grupos funcionales • Batería de grupos funcionales • suspensión de suelo • gradilla de diluciones • gradilla de nitrificadores • gradilla de celulolíticos • gradilla de amonificadores • caja de fijadores de N Estufa de incubación

14. Síntesis del análisis de grupos funcionales 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 9 ml H2O destilada por tubo + X g suelo 10° Agitar 3 minutos 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 X ml H2O destilada Recuento en medio sólido Recuento en medio líquido (Ca jas Petri) (NMP) Organismos fijadores de N Nitrificadores Celulolíticos Amonificadores ESTUFA LECTURA

15. Lectura: Amonificadores (ejemplo) Agregar reactivo Nessler El color ocre detecta presencia de amonio + + + + + - - - + 6 6 6 7 7 7 8 8 8 Contar los tubos positivos Buscar el número en la tabla de Mc. Grady Número característico 3 2 1 Número Mas Probable (NMP) = 15

16. Lectura:Celulolíticos (ejemplo) + + + + + - - + - 3 3 3 4 4 4 5 55 Observar alteración del papel Número característico 3 2 1 Número Mas Probable (NMP) = 15 Tipos de alteración del papel

17. Lectura: Fijadores (ejemplo) (-3) Contar colonias (entre 30-300) Número de colonias (UFC) = 120

18. Lectura: Nitrificadores (ejemplo) Agregar SO4H2 más difenilanida El color azul detecta presencia de nitrato + + + + - + - - + 1 1 1 2 2 2 3 3 3 Contar los tubos positivos Buscar el número en la tabla de Mc. Grady Número característico 3 2 1 Número Mas Probable (NMP) = 15

19. Tabla de Mc. Grady

20. Cálculos Objetivo: llevar la lectura a expresarla en g de nuestra muestra Nº de colonias (caja de Petri) Tubos (NMP) N en 1 ml sembrado en la caja o tubo X en 10 ml del tubo de la dilución usada (la más concentrada en el NMP) X1 en 10 ml de la dilución 10° X2 en X ml de la solución 10° (volumen de la suspensión) X2 en X g de suelo de la suspensión X en 1 g de suelo Nº de microorganismos por g de suelo

21. Actividades • Lectura de amonificadores: reacción de nessler y manejo de la tabla de Mc.Grady • Lectura de fijadores de N: crecimiento de colonias en caja de Petri • Calculo: resolver problemas de abundancia de microorganismos

22. Crecimiento exponencial Nt = N0 2n Representación semilogaritmica Representación aritmética Crecimiento bacteriano Cálculos de tiempos de generación N = N0 2n Log N = log N0 + n log 2 n = log N – log N0 log 2 g = t / n N = número final de células N0 =número inicial de células n = número de generaciones g = tiempo de generación t = horas o minutos de crecimiento exponencial

23. Logaritmo del número de células Fase de latencia Fase estacionaria Tiempo Fase exponencial (logarítmica) Fase de muerte Curva de crecimiento

24. Productos microbiológicos de carácter industrial

25. Cultivo continuo