Engenharia do DNA

1. Engenharia do DNA María Julia Barison BMP-5777 Biologia Molecular e Bioquimica de proteínas alvo a drogas do parasita da malária humana Plasmodiumfalciparum USP - 2012

2. DNA recombinante: qualquer molécula de DNA composta de sequencias derivadas de diferentes organismos. • Organismos geneticamente modificados (OGMs): qualquer organismo gerado a partir da introdução de DNA recombinante. • Aplicações: • Medicina • Produção de hormônios como insulina ou fatores de crescimento • Produção de vacinas • Pesquisa • Produção de proteínas recombinantes • knock-out e superexpressão de genes para estudos funcionais • Estudos de expressão e localização subcelular (genes repórteres) • Melhoramento animal e vegetal (OGMs)

3. 1. Fragmento de DNA de interes + Vetor 2. DNA recombinante 3. Replicação do DNA recombinante em células hospedeiras 4. Isolamento, sequenciamento e manipulação do fragmento de DNA purificado

4. 1. Fragmento de DNA de interes + Vetor • PCR DNA • Livrarias de DNA • Plasmídeo • Origem de replicação (ORI) • Marcador de seleção (resistência a ATB) • Polylinker (sítios de corte únicos para diferentes ER) • Bacteriófago Lambda/Cosmidos • BAC (Bacterial Artificial Chromosomes) • YAC VETOR Molecular CellBiology, 5ta edição

5. ENZIMAS DE RESTRIÇÃO *Extremos produzidos pelas enzimas tipo II: Bickleand Krüger (1993); Molecular CellBiology, 5ta edição

6. LIGASES OUTRAS ESTRATÉGIAS DE CLONAGEM Clonagem por recombinação Vetores tipo T - ligação

7. Replicação do DNA recombinante em células hospedeiras • Transformação: • Shock térmico • Electroporação 4. Isolamento, sequenciamento e manipulação do fragmento de DNA purificado Molecular CellBiology, 5ta edição

8. MUTAGÊNESE SÍTIO-DIRIGIDA • Tipos de mutação: • Pontual • Deleção • Inserção Mutação Pontual Sem Mutação Silenciosa Nonsense Missense conservativa Não -conservativa

9. ESTRATÉGIAS Introdução da mutação desejada Introdução da mutação desejada + sítio de restrição Sequencia de interes Primer que introduzirá ou eliminará um sítio de restrição Sítio de restrição que permitirá o screening de clones mutantes Se um sitio foi eliminado, ele pode ser utilizado para aumentar a proporção de clones mutados.

10. Sistema pALTER

11. Mutagênesis sítio dirigida mediante OverlapExtension PCR PCR Clonagem Desnaturação Amplificação Re-hibridação Extensão Ho, S. N et al (1989)

12. Screening dos clones mutados: • Análise por digestão com enzimas de restrição • Identificação do clone por hibridação com sonda marcada Colonias de bacterias levando o plasmídeo mutado Membrana de nitrocelulosa Incubação da membrana com solução alcalina DNAss unido à membrana Hibridação com sonda marcada Sinal positivo Adaptado de Molecular CellBiology, 5ta edição

13. Obrigada pela atenção!!...