Spektrometria mas MALDI-TOF/TOF

1. Spektrometria mas MALDI-TOF/TOF Kazimierz Dąbrowski Katedra Chemii i Technologii Polimerów Wydział Chemiczny PW Warszawa, 16.04.2012

2. Najważniejsze odkrycia w historii spektrometrii mas

3. Podstawowe definicje

4. Najczęściej stosowane skróty EI (ElectronImpact) - jonizacja elektronamiMALDI (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization) - jonizacja laserem wspomagana matrycąESI (ElectrosprayIonization) - jonizacja przez rozpylanie w polu elektrycznymHPLC (High Performance Liquid Chromatography) - wysokosprawna chromatografia cieczowa)MS/MS (Tandem Mass Spectrometry) - tandemowa spektrometria masowaTOF  (Time of Flight Analyser) - analizator czasu przelotuPSD (Post Source Decay) - rozpad poza źródłem jonówm/z - stosunek wartości masy do liczby ładunkówDIOS (Desorption/Ionization on PorousSilicon) - desorpcja/jonizacja na porowatym krzemieICP  (InductivelyCoupledPlasma) - jonizacja plazmą wzbudzoną indukcyjnie

5. Idea działania spektrometru mas • źródło jonów – urządzenie, w którym następuje jonizacja cząsteczek przy użyciu różnorodnych technik, z których część prowadzi do pękania wiązań chemicznych na skutek czego dochodzi do ich podziału na mniejsze fragmenty. Inne techniki powodują tylko naładowanie cząsteczek bez ich fragmentacji, • analizator – w którym wcześniej powstałe jony ulegają rozdziałowi na podstawie stosunku ich masy do ładunku. • detektor – urządzenie "zliczające" jony napływające z analizatora.

6. Jonizacja próbki

7. Jonizacja próbki cd.

9. Jonizacja próbki – lasery używane w technice MALDI Nitrogen laser: pro: well structured energy profile contra: slow (maximum 50Hz) Nd:YAG laser: pro: fast (up to 1000Hz) contra: Gaussian energy profile (non-structured) Smartbeam/Smartbeam II (modified Nd:YAG laser): pro: fast (up to 1000Hz) pro: well structured energy profile A. Holle, A. Haase, M. Kayser, J. Höhndorf, Journal of Mass Spectrometry, 41, 705-716 (2006)

10. Matryce Procesy zachodzące pod wpływem impulsu laserowego Absorpcja promieniowania głównie przez materiał matrycy. Odparowanie próbki na głębokość 2-3 li wyrzucenie strumienia gazów prostopadle do jej powierzchni. Dysocjacja termiczna matrycy. Tworzenie jonów (głównie H+, Na+, K+). Reakcje jonów z badaną substancją i matrycą. Możliwe drogi: - dysocjacja termiczna z utworzeniem pary kation-anion - oderwanie elektronu - oderwanie bądź przyłączenie protonu - przyłączenie kationu bądź anionu

11. Matryce • Pożądanymi cechami matrycy MALDI są: • dość niska masa cząsteczkowa, co sprzyja łatwemu odparowaniu, ale wystarczająco duża, by odparowanie nie nastąpiło przed pomiarem, np. w czasie przygotowywania próbki; • rozpuszczalność w rozpuszczalniku kompatybilnym z analitem; • kwasowość, by ułatwić protonowanie cząsteczek analitu; • obecność grup polarnych (hydrofilowych) w cząsteczce, co umożliwia rozpuszczanie matrycy w roztworach wodnych; • stabilność w warunkach wysokiej próżni; • wspomaganie jonizacji analitu; • zdolność intensywnej absorpcji promieniowania UV lasera; zwykle wymóg ten spełnia związek, posiadający układ sprzężonych wiązań podwójnych C=C (dlatego często matrycami są pochodne aromatycznych kwasów karboksylowych, często nienasyconych, np. kwasu cynamonowego).

12. Matryce Sinapicacid Kwas 3-5-dimetoksy-4-hydroksy cynamonowy SINA proteiny Gentisicacid Kwas 2-5-dihroksy benzoesowy DHB peptydy 2-(4-Hydroxyphenylazo)benzoicacid Kwas 2-(4-hydroksyfenylazo)- benzoesowy HABA Peptydy, polimery Dithranol 1,8-Dihydroksyantracen-9(10H)-on DIT polimery α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid Kwas α-Cyano-4-hroksy cynamonowy CHCA, α-CHCA Peptydy, lipidy 2,4,6-Trihydroxyacetophenone 2,4,6-trihroksy acetofenon THAP oligonukleotydy

13. Tryb liniowy

14. Tryb liniowy • Jak zwiększyć rozdzielczość? • Pulsedionextraction – polepszenie ogniskowania jonów • Optymalizacja przygotowania próbki – homogenizacja • Użycie reflektronu

15. Optymalne przygotowanie próbki

16. Najczęściej stosowane metody nanoszenia próbki (analitu i matrycy) to: Metoda wysychającej kropli (drieddropletmethod) – jednowarstwowa:Przyrządza się osobno roztwór próbki i roztwór matrycy w tym samym rozpuszczalniku, lub – jeśli to niemożliwe – w dwóch kompatybilnych; niekiedy jeszcze używa się trzeciego roztworu - środka kationizującego, np. soli metalu (możliwe są różne rozpuszczalniki i stężenie). Wszystkie roztwory miesza się, a uzyskaną mieszaninę (0,5÷1 μl) umieszcza na płytce MALDI (MALDI target) i pozostawia do wyschnięcia na powietrzu. Wadą tej metody jest powolne wysychanie próbki, co może prowadzić do rozdzielenia kryształów matrycy próbki i soli kationizującej.Modyfikacjami tej metody są: zastosowanie odparowywania próżniowego lub odparowywanie w strumieniu ultraczystego azotu. W obu przypadkach otrzymuje się drobniejsze kryształy, lepszą rozdzielczość i powtarzalność oraz intensywność sygnałów. Metoda cienkiej warstwy (thin-layermethod) – dwuwarstwowa:Roztwór matrycy w odpowiednim rozpuszczalniku (np. dla CHCA – roztwór nasycony w acetonie) nanosi się na płytkę MALDI i pozwala mu się wyschnąć, otrzymując cienką warstwę matrycy. Następnie 1 μl roztworu analitu nanosi się na wierzch uzyskanej powierzchni matrycy i suszy. Nanoszenie przez rozpylanie. Wariantami tej metody są: osadzanie strumieniem powietrza (air spray deposition) i osadzanie przez elektrosprej (electrospraysampledepositon). Metoda mieszania ciał stałych (solid/solidsamplepreparation):Metoda polega na bardzo dokładnym mieszaniu drobno sproszkowanych matrycy i próbki (bez rozpuszczalnika) i prasowaniu całości w pastylkę. Stosuje się ją dla niektórych poliamidów, nierozpuszczalnych w pospolitych rozpuszczalnikach organicznych

17. Epot = zeUEkin = 1/2mv2 zeU = 1/2mv2v = (2zeU/m)1/2 t = L×(1/2eU)1/2×(m/z)1/2

18. Tryb reflektronu

19. Tryb reflektronu

21. Profil izotopowy

22. Profil izotopowy C41H69N13O14S [M+H]+: 1000.4880 [M+H]+: 1001.1409 C112H164N29O34S2 [M+H]+: 2524.1510 [M+H]+: 2525.8196 C253H363N55O75S [M+H]+: 5404.6075 [M+H]+: 5407.9984 Masa monoizotopowa Masa średnia

23. Kalibracja tof= tdelay+ tacc + tdrift F = E q = M a d = a/2 tacc2 E = U/d q = z e tacc = d √(2m/Uze) tdrift= L √(m/2zeU) tof=tdelay + d √(2m/Uze) + L √(m/2zeU) tof=tdelay + (d √(2/Ue)+L √(1/2Ue)) × √(m/z) t = C0+C1√(m/z)

24. MALDI–ToF/ToF Ionpath in TOF1 region (linear TOF) Ionpath in TOF2 region (reflectorTOF) Ion source1 = MALDI ionsource Ion source2 = LIFT re-accelerationcell PCIS = Timediongate PLMS = Post LIFT meta stablesuppressor

25. MALDI–ToF/ToF

26. MALDI–ToFw badaniach polimerów • Za pomocą MALDI można wyznaczyć następujące parametry polimerów: • Mn, Mw, PD • grupy końcowe polimeru • budowę kopolimeru Montaudo G, J. Polym. Sci. A: Polym. Chem. 34, 1996, 439-447

27. C B A A9B2C A10B2C A8B2C A9BC A9B3C A10BC A8B3C A11BC A7B3C A8B4C A7B4C A6B4C A10C A11C A11C

28. Polimery polarne: poliwęglany, politlenki olefin  Polikwasy, poliestry, polimery słabo polarne (np. polistyren)  Polisacharydy, teflon, poliolefiny mass discriminationeffect

29. MALDI mass spectra of a poly(alkylthiophene) fractionated with acetone, hexanes, methylenechloride, THF, and chloroform Liu, J.; Loewe, R. S.; McCullough, R. D. Macromolecules1999, 32, 5777 -5785.

31. Wskazówkidla PT Klientów • Badane mogą być związki stałe, ewentualnie ciecze nielotne (ciśnienie w komorze pomiarowej < 10-7Torr). • Do pomiaru używamy zazwyczaj 5 mg substancji. Próbki można dostarczać albo już odważone (proszę podać masę próbki), lub w większych pojemnikach. • W razie tzw. wyższej konieczności do pomiaru wystarczy: substancji typu biologicznego (np. peptydu) 0,1 - 10 pmol, polimeru 50 - 200 pmol. • Można również dostarczyć próbkę w postaci roztworu w dowolnym, ale koniecznie lotnym i niekorodującym rozpuszczalniku (prosimy o podanie stężenia roztworu !) • Możliwy jest pomiar próbki nierozpuszczalnej, ale wówczas musi być ona w postaci możliwie drobnego proszku. Należy jednak podkreślić, że wyniki takiego pomiaru będą znacznie gorszej jakości, niż próbek rozpuszczalnych. • Kategorycznie odmawiamy przyjmowania podejrzanych, dymiących cieczy zawierających stężone lotne kwasy (np. HCI, HNO3) oraz substancji korodujących typu POCI3, wolne aminy, fenole, merkaptany itd. • Aby proces tworzenia jonów przebiegał możliwie wydajnie, próbka powinna być jak najczystsza. W szczególności nie powinna zawierać: • nadmiaru soli nieorganicznych z grupy litowców i miedziowców, • detergentów !!!, • buforów, zwłaszcza fosforanowych, • substancji silnie alkalizujących (reagują z matrycą), • W przypadku polimerów, co do których zachodzi podejrzenie, że mogą zawierać frakcje znacznie różniące się masą cząsteczkową ( np. Mn = 1 500 i Mn = 30 000) niezbędne jest wstępne rozdzielenie próbki na frakcje. • Prosimy o podanie spodziewanej masy cząsteczkowej, bądź przynajmniej zakwalifikowanie próbki do jednego z następujących przedziałów: < 5000; 5000-20000; > 20000 • Do badanej próbki (lub grupy próbek) prosimy dołączyć „Zlecenie wykonania badania MALDI-ToF” (druk dostępny na stronie: www.ch.pw.edu.pl/~maldi)

33. Polecana literatura • M. Karas, D. Bachmann, F. Hillenkamp; AnalyticalChemistry, 57, 2935-2939 (1985) • K. Tanaka, H. Waiki, Y. Ido, S. Akita, Y. Yoshida, T. Yoshida; RapidCommunications in Mass Spectrometry, 2, 151-153 (1988) • R. C. Beavis, B. Chait, K.G. Standing; RapidCommunications in Mass Spectrometry, 3, 233-237 (1989) • M. Karas, M. Glückmann, J. Schäfer; Journalof Mass Spectrometry, 35, 1-12, (2000) • R. Zenobi and R. Knochenmuss; Mass SpectrometryReviews, 17, 337-366 (1998) • G. Montaudo, M. S. Montaudo, and F. Samperi, “ MassSpectrometry of Polymers ”, ed. G. Montaudo and R. P.Lattimer, 2002 , CRC Press, Boca Raton, FL, 419.

34. Dziękuję za uwagę…