Virológica y Diagnostico Influenza A H1/N1

1. Virológica y Diagnostico Influenza A H1/N1

2. Objetivo • Describir las características generales del Virus de Influenza A H1/N1 • Describir los Criterios Diagnósticos del virus A H1/N1y uso de las herramientas de Laboratorio

3. Influenza LA INFLUENZA ES PRODUCIDA POR UN VIRUS DE LA FAMILIA ORTOMIXOVIRIDAE (ortomixovirus) • ESFÉRICO-PLEOMÓRFICO • DIAMETRO DE 80 A 120 nm • RNA DE CADENA SENCILLA, SEGMENTADO Y SENTIDO NEGATIVO • COMPUESTO POR PROTEÍNAS ESTRUCTURALES • PROTEÍNAS DE SUPERFICIE: HEMAGLUTININA Y NEURAMINIDASA

7. Características del virus

8. Nomenclatura de los virus de la Influenza Virus tipo A A/Singapore/6/86 Tipo de virus Sitio de aislamiento H1N1* Codigo del Lab/número del cultivo Año de aislamiento HA subtipo * subtipos para el virus A solamente NA subtipo

9. TIEMPO DE APARICION VIRUS DE INFLUENZA A EN HUMANOS Influenza AVIAR H9 H7 H1 SOIV H5 H5 FLU Hong Kong FLU ASIATICA H3 Influenza ESPAÑOLA H2 H1 H1N1 1918 1957 1977 1997 2005 2009 1968 (A/WS/1933)

10. Curva epidémica Total de casos confirmados: 24,686 Fuentes: Base de datos InDRE y CONAMED.

11. Diagnóstico de influenza Dr. Jorge Duque Rodríguez

12. ¿Cómo hacemos el diagnóstico de este virus antes y en la pandemia actual? • ¿Qué utilidad tienen las pruebas rápidas? • En que consiste la prueba de PCR en tiempo real • ¿ Para que se requiere el diagnóstico? • ¿A quién muestrear? • ¿Como se toman y transportan las muestras? • Conclusiones

13. ESTRUCTURA DE LOS VIRUS DE INFLUENZA Proteína M2 RNA viral Neuraminidasa(NA) 9 diferentes Hemaglutinina (HA) 16 diferentes Membrana lipidica

14. Duración de excreción viral como base de la muestra para el diagnóstico: • La duración de excreción viral es desconocida • Los datos actuales son respecto de Influenza estacional • El diagnóstico debe ser para Influenza • La mayor excreción viral constante y accesible para detección, es en vía respiratoria superior • El virus se ha demostrado que se excreta en heces, orina y otras secreciones • La técnica estándar de diagnóstico es en secreciones de vía respiratoria • Se asume que las personas infectadas pueden ser potencialmente infectantes mientrás dura la fiebre o hasta 7 días de la enfermedad • Se asume que niños pequeños y los inmunocomprometidos pueden excretar por más días.

15. Toma de la muestra

16. Métodos para diagnóstico de influenza La batería de métodos para diagnóstico de influenza por laboratorio se puede agrupar : Detección directa del virus, material genético o moléculas virales Detección de anticuerpos en contra del virus Consideraciones para uso de método diagóstico Sensibilidad Especificidad Tiempo de obtención de resultados Disponibilidad de la prueba en los laboratorios Facilidad de realización Costos asociados con la misma.

17. A quién tomar muestra? Enfermedad tipo influenza (ETI): Persona de cualquier edad que presente o refiera haber tenido fiebre mayor o igual a 38°C, tos, y cefalea, acompañadas de uno o más de los siguientes signos o síntomas: rinorrea, coriza, artralgias, mialgias, postración, odinofagia, dolor torácico, dolor abdominal, congestión nasal, diarrea. En menores de cinco años de edad, se considera como un signo cardinal la irritabilidad, en sustitución de la cefalea. En mayores de 65 años, no se requerirá la fiebre como síntoma cardinal. Infección respiratoria aguda grave (IRAG): Persona de cualquier edad que presente dificultad al respirar, acompañada de fiebre mayor o igual a 38°C y tos, con uno o más de los siguientes síntomas: ataque al estado general, dolor torácico, polipnea, Defunción Síndrome de Insuficiencia Respiratoria Aguda (SIRA) Defunción por neumonía grave con sospecha de influenza: toda defunción por infección respiratoria aguda grave según se define en el párrafo anterior.

21. Inmunofluorescencia : Solo define INF A o B Sensibilidad de 70-100% (80%), especificidad entre 80 y 100% Técnica de opción cuando se requieren resultados relativamente rápidos Aprobada por la OMS Epidemia actual en México: En un universo de 6,503 muestras provenientes de todo el país, Sensibilidad de 31.2% Especificidad de 98.5%. IFI no tiene la suficiente sensibilidad como prueba tamiz para la vigilancia del S-OIV de la epidemia en México (manuscrito en preparación). VPP = 89.3%, VPN = 77.9%

22. Pruebas rápidas • Tienen la ventaja de no requerir instalaciones de laboratorio BSL-2 ni BSL-3 y se usan en consultorio. • Solo detectan INF A y B y no detectan diferencia entre los subtipos humanos (H1N1 y H3N2) o sub-especies aviares (H5N1, H7N1, etc.). • No discrimina entre Inf A y el nuevo virus S-OIV • La sensibilidad para este tipo de pruebas está en el rango entre 40 - 80%, y depende básicamente del tipo de muestra analizada y del tipo de paciente de quien derivan. • La sensibilidad en pacientes adultos es más baja que las reportadas en niños y jóvenes. • La mayoría de las pruebas rápidas para la detección de virus de influenza B tienen una sensibilidad más baja que aquellas que detectan virus de influenza A • Las especificidades reportadas varían entre el 85 y el 100%

23. Pruebas rápidas • CDC realizó una evaluación preliminar de múltiples pruebas rápidas vs PCR Tiempo real: Los resultados mostraron que, aunque las pruebas rápidas pudieron detectar INFA correspondiente al virus S-OIV 2009 a partir de muestras respiratorias con mas altos niveles de virus • La sensibilidad para S-OIV = 51% (IC 35-67%) AH1 estacional = 65% (IC 39-82%) AH3 estacional = 31% (IC 14-37%) Especificidad de 99% • Otros estudios entre 10-51% • La prueba Quidel QuickVue (Quidel Corp., San Diego, CA.) utilizada durante la epidemia en México solo presentó una sensibilidad de 34.0% y una especificidad de 97.6%, con VPP y VPN de 75.6% y 86.2% respectivamente, cuando se comparó contra rRT-PCR en el InDRE (manuscrito en preparación)

24. RED DE LABORATORIOS ANALIZANDO MUESTRAS DIAGNOSTICO INFLUENZA, A H1N1/swl Protocolo de CDC para RT-PCR en tiempo real de la influenza A (H1N1)swl 28 de abril de 2009 Revisión 1 (30 de abril de 2009) El Centro Colaborador de la Organización Mundial de la Salud (OMS) para la influenza en los CDC de Atlanta, EUA, ha puesto a disposición el protocolo adjunto para la realización de la prueba RT-PCR en tiempo real para la influenza A (H1N1)/Swl

25. Diagrama de flujo establecido para detección y caracterización de Influenza S-OIV Recepción de Muestras 1 h por cada 150 muestras Tratamiento e inactivación de muestras Extracción RNA 1:20 h x cada 30 muestras Preparación de reactivos Montaje de placas 1:00 a 1:15 h x cada 44 muestras Instrumentación rRT-PCR 2:30 h x máquina por corrida x c/22 muestras Interpretación 15 a 30 minutos interpretación x máquina x ciclo Total 5.5 horas para una muestra

26. Unión de la sonda de hidrólisis

27. Iniciadores y sondas para cada segmento: doble control de identificación

28. Influenza A H1/Swl RESULTADOS INF-A humana NEG

29. INTERPRETACION

30. Como trabaja la nueva red de diagnóstico Sistema de Vigilancia Sentinela-SISVEFLU Va de local-regional- InDRE Preparación de reactivos Un área de apertura de muestras, alícuotas e inactivación (BSL2, con prácticas BSL3 Extracción RNA Área exclusiva para master mix Instrumentacion rRT-PCR Lectura de resultados Logística informática para todo el proceso, emisión de resultados, análisis de resultado y reporte

32. CONCLUSIONES Pandemia (H1N1) S-OIV • Antigenicidad similar, mutaciones puntuales no significativas (hasta ahora) • No se reconoce evidencia de marcadores de virulencia • Casi todos sensibles a inhibidores de nauraminidasa (oseltamivir y zanamivir) • Casos recientes aislados de resistencia a oseltamimivir • Inevitable la variación genética del virus, no podemos predecir si eso resulta en más virulencia o más resistencia