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Estudio de la Regulación Epigenética de la Vía Wnt por Metilación Aberrante de sus Genes Represores en la Leucemia Mielo

Estudio de la Regulación Epigenética de la Vía Wnt por Metilación Aberrante de sus Genes Represores en la Leucemia Mieloblástica Aguda. Ana Belén Valencia Martínez Servicio de Hematología Hospital Universitario La Fe. Valencia, 28 Septiembre 2010. Introducción Leucemia Mieloide Aguda.

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Estudio de la Regulación Epigenética de la Vía Wnt por Metilación Aberrante de sus Genes Represores en la Leucemia Mielo

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  1. Estudio de la Regulación Epigenética de la Vía Wnt por Metilación Aberrante de sus Genes Represores en la Leucemia Mieloblástica Aguda Ana Belén Valencia Martínez Servicio de Hematología Hospital Universitario La Fe Valencia, 28 Septiembre 2010

  2. IntroducciónLeucemia Mieloide Aguda Definición La leucemia mieloide aguda (LMA) es una enfermedad neoplásica en la que se produce una proliferación anómala de células inmaduras (blastos) de estirpe mieloide. Las células blásticas proceden de un único progenitor hematopoyético defectuoso que presenta un bloqueo en el proceso normal de maduración así como un aumento de su capacidad de proliferación.

  3. IntroducciónLeucemia Mieloide Aguda Eritrocitos Progenitores mieloides CMH Plaquetas Granulocitos Macrófagos Hematopoyesis normal Expansión clonal Mutación Mutación Leucemia Mieloide Aguda

  4. IntroducciónLeucemia Mieloide Aguda Clasificación OMS 2008

  5. IntroducciónLeucemia Mieloide Aguda 40 - 50% Citogenética RC (%) RR (%) SG (%) 55 - 65 84 - 91 21 - 35 24 - 41 76 - 86 51 - 67 63 - 22 63 - 22 Extraído de Grimwade et al. Blood 1998

  6. IntroducciónLeucemia Mieloide Aguda Alteraciones moleculares

  7. IntroducciónMetilación del ADN • En el inicio y la progresión del cáncer intervienen tanto alteraciones genéticas como epigenéticas. • Asociadas a silenciamiento génico. • Las alteraciones epigenéticas son reversibles. NH2 NH2 CH3 N DNMT N 4 4 3 5 3 5 2 6 2 6 S-adenosil-methionine 1 1 O O N N citosina 5-metilcitosina

  8. IntroducciónMetilación del ADN Exón 1 Exón 2 Exón 3 • Los dinucleótidos CpG se agrupan en las regiones promotoras de algunos genes (islas CpG). • Islas CpG no metiladas en regiones promotoras de algunos genes.

  9. IntroducciónMetilación del ADN Célula normal Exón 1 Exón 2 Exón 3 Región promotora X Exón 1 Exón 2 Exón 3 Célula tumoral

  10. IntroducciónMetilación del ADN Genes hipermetilados en cáncer Angiogénesis Ciclo celular Reparación Apoptosis Adhesión Transd. señal THBS1 APC, PTEN ER, SOCS1 RASSF1 HIC1 DAPK TMS1 APAF Casp8 hMLH1 hMLH2 MGMT BRCA1 E-CAD TIMP3 MASPIN FAT p15, p16, p14, p73, p21, p57, Rb Proliferación Inestabilidadgenómica Diferenciación Apoptosis

  11. IntroducciónMetilación del ADN Agentes hipometilantes DNMT Azacitidina CH3 CH3 ACGTCACGA Decitabina DNMT AAzGTCAAzGA

  12. IntroducciónLa vía de señalización Wnt Vías de señalización PI3K/AKT WNT PI3K/AKT JAK/STAT

  13. IntroducciónLa vía de señalización Wnt Descripción de la vía Wnt • Embriones: Desarrollo y diferenciación de tejidos y órganos. • Adultos: Mecanismos de renovación, diferenciación y proliferación de las células madre. • Implicada en distintos tumores.

  14. IntroducciónLa vía de señalización Wnt Vía Wnt activa DKK sFRP Wnt axina Lrp axina Lrp APC GSK-3β APC Fz Fz CKLα GSK-3β CKLα β-Catenina β-Catenina P P P LEF Groucho Groucho β-catenina LEF TCF TCF Proteosoma ciclina D1 / c-myc ciclina D1 / c-myc Vía Wnt inactiva Citoplasma Citoplasma

  15. IntroducciónLa vía de señalización Wnt DKK sFRP Vía Wnt inactiva Vía Wnt activa Vía Wnt inactiva Citoplasma Citoplasma Wnt axina Lrp axina axina Lrp GSK-3β APC GSK-3β GSK-3β APC APC Fz Fz Fz CKLα CKLα CKLα β-Catenina β-Catenina P P P P P P LEF LEF Groucho Groucho TCF TCF Proteosoma Proteosoma ciclina D1 / c-myc ciclina D1 / c-myc

  16. IntroducciónLa vía de señalización Wnt DKK sFRP Desregulación de la vía Wnt Cáncer de colon Neoplasias hematológicas Wnt Carcinomas hepatocelulares axina Lrp Leucemias Fz Cáncer de colon APC GSK-3β CKLα Cáncer de colon Melanomas β-Catenina Groucho β-catenina LEF TCF

  17. Hypothesis Alterations of different components of the Wnt pathway have been found in some hematological malignances providing evidence for the involvement of the Wnt pathway in leukemogenesis. We hypothesize that the functional loss of Wnt antagonists by promoter hypermethylation is a possible mechanism contributing to activation of the Wnt pathway in AML and that this loss may be involved in the pathogenesis and prognosis of this disease.

  18. Objectives • To study the methylation status of the Wnt antagonists: sFRP1, sFRP2, sFRP4, sFRP5, DKK1 and DKK3 in cell lines of myeloid lineage as well as in a large series of 184 patients diagnosed with de novo non-M3 AML. • To evaluate the impact of aberrant methylation of Wnt antagonists in gene expression using the hypomethylating agent decitabine (DAC). • To demonstrate the association between aberrant methylation of Wnt antagonists and activation of the Wnt pathway in AML, analyzing the expression of Wnt downstream genes (cyclin D1, TCF and LEF) and the location of β-catenin using cell cultures treated with DAC.

  19. Objectives • To analyse the association of any individual gene and the methylation profile (group A: patients with 0-1 methylated genes; group B: patients with 2-6 methylated genes) with the clinical and biological characteristics of the AML patients. • To evaluate the prognostic impact of the aberrant methylation of Wnt antagonists on the outcome of the AML patients.

  20. MetodologíaLíneas celulares y pacientes Líneas celulares Pacientes • Kasumi-1 • KG-1a • HL-60 • THP-1 • 184 pacientes con LMA • 110 hombres, 74 mujeres • Mediana edad: 60 años • Citogenética: • FLT3-ITD (n = 159): 31 • NPM1 mutado (n = 105): 27 Favorable = 15 Intermedio = 111 Adverso = 38

  21. Objectives • To study the methylation status of the Wnt antagonists: sFRP1, sFRP2, sFRP4, sFRP5, DKK1 and DKK3 in cell lines of myeloid lineage as well as in a large series of 184 patients diagnosed with de novo non-M3 AML. • To evaluate the impact of aberrant methylation of Wnt antagonists in gene expression using the hypomethylating agent decitabine (DAC). • To demonstrate the association between aberrant methylation of Wnt antagonists and activation of the Wnt pathway in AML, analyzing the expression of Wnt downstream genes (cyclin D1, TCF and LEF) and the location of β-catenin using cell cultures treated with DAC.

  22. MétodosEstudio del estado de metilación CH3 Bisulfito sódico CpG CpG CH3 MSP Cebadores M Cebadores U CpG UpG U U M M PCR específica de metilación

  23. ResultadosEstudio del estado de metilación Metilación genes antagonistas Wnt Líneas celulares Pacientes, n = 184 Grupo A (0-1 genes metilados):57% Grupo B (2-6 genes metilados):43%

  24. Objectives • To study the methylation status of the Wnt antagonists: sFRP1, sFRP2, sFRP4, sFRP5, DKK1 and DKK3 in cell lines of myeloid lineage as well as in a large series of 184 patients diagnosed with de novo non-M3 AML. • To evaluate the impact of aberrant methylation of Wnt antagonists in gene expression using the hypomethylating agent decitabine (DAC). • To demonstrate the association between aberrant methylation of Wnt antagonists and activation of the Wnt pathway in AML, analyzing the expression of Wnt downstream genes (cyclin D1, TCF and LEF) and the location of β-catenin using cell cultures treated with DAC.

  25. MétodosReactivación de la expresión con DAC Extracción ARN Tratamientos con DAC Kasumi-1 KG-1a Kasumi-1 KG-1a Día 0 RNA RNA HL-60 THP-1 HL-60 THP-1 Control DAC 2µM Kasumi-1 KG-1a Kasumi-1 KG-1a RNA RNA Día 4 HL-60 THP-1 HL-60 THP-1 Control DAC 2µM

  26. MétodosReactivación de la expresión con DAC Extracción ARN Tratamientos con DAC Kasumi-1 KG-1a Kasumi-1 KG-1a Día 0 RNA RNA HL-60 THP-1 HL-60 THP-1 Control DAC 2µM RNA cDNA Genes antagonistas Kasumi-1 KG-1a Kasumi-1 KG-1a RNA RNA Día 4 HL-60 THP-1 HL-60 THP-1 Control DAC 2µM

  27. ResultadosReactivación de la expresión con DAC Kasumi-1 KG-1a Ratio Normalizado de Expresión % Ratio Normalizado de Expresión % Ratio Normalizado de Expresión % Ratio Normalizado de Expresión % sFRP1 sFRP2 sFRP4 sFRP5 DKK1 DKK3 sFRP1 sFRP2 sFRP4 sFRP5 DKK1 DKK3 sFRP1 sFRP2 sFRP4 sFRP5 DKK1 DKK3 HL-60 TPH-1 DAC 2µM Ratio Normalizado de Expresión % Ratio Normalizado de Expresión % sFRP1 sFRP2 sFRP4 sFRP5 DKK1 DKK3 sFRP1 sFRP2 sFRP4 sFRP5 DKK1 DKK3 Expresión genes antagonistas Wnt DAC 2µM Día 4 Control

  28. Objectives • To study the methylation status of the Wnt antagonists: sFRP1, sFRP2, sFRP4, sFRP5, DKK1 and DKK3 in cell lines of myeloid lineage as well as in a large series of 184 patients diagnosed with de novo non-M3 AML. • To evaluate the impact of aberrant methylation of Wnt antagonists in gene expression using the hypomethylating agent decitabine (DAC). • To demonstrate the association between aberrant methylation of Wnt antagonists and activation of the Wnt pathway in AML, analyzing the expression of Wnt downstream genes (cyclin D1, TCF and LEF) and the location of β-catenin using cell cultures treated with DAC.

  29. ResultadosActivación aberrante de la vía Wnt Kasumi-1 KG-1a Ratio Normalizado de Expresión % Ratio Normalizado de Expresión % ciclina D1 TCF LEF ciclina D1 TCF LEF TPH-1 HL-60 DAC 2µM Ratio Normalizado de Expresión % Control Ratio Normalizado de Expresión % ciclina D1 TCF LEF ciclina D1 TCF LEF Expresión genes activadores Wnt DAC 2µM Día 4

  30. MétodosActivación aberrante de la vía Wnt Localización β-catenina Kasumi-1 KG-1a Kasumi-1 KG-1a Día 0 HL-60 THP-1 HL-60 THP-1 Control DAC 2µM Kasumi-1 Kasumi-1 KG-1a KG-1a Día 4 Proteínas Proteínas HL-60 HL-60 THP-1 THP-1 Control DAC 2µM

  31. MétodosActivación aberrante de la vía Wnt Western blot Extracción de proteínas Fracción NUCLEAR Fracción CITOPLASMÁTICA β-tubulina β-catenina TOTAL Lamin A β-catenina TOTAL

  32. ResultadosActivación aberrante de la vía Wnt ´ Localización β-catenina

  33. ResultadosActivación aberrante de la vía Wnt CH3 CH3 X DKK X sFRP axina axina APC APC GSK-3β GSK-3β CKLα CKLα β-catenina β-catenina P P P LEF LEF β-catenina Groucho TCF TCF X ciclina D1 ciclina D1 + DAC LMA Wnt Lrp Fz

  34. ResultadosActivación aberrante de la vía Wnt CH3 CH3 X DKK X sFRP axina axina APC APC GSK-3β GSK-3β CKLα CKLα β-catenina β-catenina P P P LEF LEF β-catenina Groucho TCF TCF Proteosoma X ciclina D1 ciclina D1 + DAC LMA Wnt Lrp Fz

  35. ResultadosActivación aberrante de la vía Wnt Expresión genes activadores Wnt Pacientes ciclina-D1 TCF LEF P = 0,021 P = 0,045 P = 0,023 Ratio Normalizado IC 95% Ratio Normalizado IC 95% Ratio Normalizado IC 95% Grupo A Grupo B Grupo A Grupo B Grupo A Grupo B

  36. Objectives • To analyse the association of any individual gene and the methylation profile (group A: patients with 0-1 methylated genes; group B: patients with 2-6 methylated genes) with the clinical and biological characteristics of the AML patients. • To evaluate the prognostic impact of the aberrant methylation of Wnt antagonists on the outcome of the AML patients.

  37. ResultadosAsociación con características clínicas Características clínico-biológicas

  38. ResultadosAsociación con características clínicas Respuesta a la inducción

  39. Objectives • To analyse the association of any individual gene and the methylation profile (group A: patients with 0-1 methylated genes; group B: patients with 2-6 methylated genes) with the clinical and biological characteristics of the AML patients. • To evaluate the prognostic impact of the aberrant methylation of Wnt antagonists on the outcome of the AML patients.

  40. ResultadosAnálisis de supervivencia Serie global * HR: Hazard Ratio

  41. ResultadosAnálisis de supervivencia SLR SG SLE P = 0,026 P = 0,035 P = 0,046 Supervivencia acum Supervivencia acum Supervivencia acum Meses Meses Meses FLT3-ITD Negativo FLT3-ITD Positivo ----- Pacientes ≤ 60 años Grupo citogenético INTERMEDIO

  42. ResultadosAnálisis de supervivencia Pacientes ≤ 60 años Grupo citogenético INTERMEDIO SLR SG SLE P = 0,032 P = 0,011 P = 0,020 Supervivencia acum Supervivencia acum Supervivencia acum Meses Meses Meses Grupo A (0-1 genes metilados) Grupo B (2-6 genes metilados) -----

  43. ResultadosAnálisis de supervivencia Pacientes ≤ 60 años Grupo citogenético INTERMEDIO * HR: Hazard Ratio

  44. Conclusions • Aberrant methylation of the Wnt antagonists is a frequent event in cell lines of myeloid lineage and in patients diagnosed with AML. Indeed, we have found concurrent methylation of two or more genes in 43% of the AML patients. • Aberrant promoter methylation results in gene silencing of Wnt antagonists.

  45. Conclusions • Treatment with DAC of the AML cell lines permit the re-expression of the Wnt antagonists and therefore, induce a reduction of β-catenin in the nuclear localization and downregulate the expression of the Wnt downstream genes. In concordance, the transcription levels of cyclin D1, TCF and LEF are significantly higher in patients showing more that two Wnt antagonist methylated genes. This is a strong evidence that epigenetic regulation contributes at least in part to the activation of the Wnt pathway in AML.

  46. Conclusions • Aberrant methylation of any individual gene and the methylation profile are not associated with clinical and biological characteristics of the AML patients in our series. The exception is for aberrant methylation of sFRP5, which is detected more frequently in patients with an adverse prognosis. Therefore, methylation of sFRP5 might provide valuable information about poor outcome in AML. 5. Methylation of two or more Wnt antagonistic genes is a new adverse prognostic factor in the subgroup of patients ≤ 60 years with intermediate-risk cytogenetics.

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