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Enterobactérias e outras bactérias Gram gram negativas. Laboratório Clínico 4o ano Biomedicina. Enterobacteriaceae. maior e mais heterogênea família de bactérias Gram negativas de importância clínica - representam 80% ou mais de todos os Gram negativos isolados na rotina microbiológica
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Enterobactérias e outras bactérias Gram gram negativas • Laboratório Clínico • 4o ano Biomedicina
Enterobacteriaceae • maior e mais heterogênea família de bactérias Gram negativas de importância clínica • - representam 80% ou mais de todos os Gram negativos isolados na rotina microbiológica • - são responsáveis por cerca de 70% das infecções urináias e 50% das septicemias • Constituída por 27 gêneros / 102 espécies / 08 grupos indefinidos. • Independente da complexidade, mais de 95% das amostras implicadas em caso clínicos são colocadas em 25 espécies E. coli Klebsiella sp
Enterobacteriaceae • Definição • Bacilos Gram negativos • Fermentadores da glicose • Oxidase negativa e catalase + • Ausência da atividade da citocromo-oxidasediferencia de outros gram-negativos • Móveis / imóveis • Crescem em meios comuns - meios básicos (caldo peptona) - meios ricos (ágar sangue, ágar chocolate e CLED) – meios seletivos (Mac Conkey) • Reduzem os nitratos a nitritos • Habitat • Plantas, solo, água, intestino do homem e animais
Enterobacteriaceae • Nomenclatura e Classificação • Métodos Fenotípicos • Moleculares novas espécies • reclassificação • Classificação • Gêneros ( dezenas) • Espécies ( centenas ) • biotipos e sorotipos • Complexos
Enterobacteriaceae Enterobacteriaceas com importância médica • • Escherichia coli • •Klebsiella pneumoniae • •Proteus mirabilis e P. vulgaris • •Enterobacter spp • •Salmonella typhi e S. paratyphi A e B • •Salmonella enteritidis e S. cholerae suis • •Shigella spp • •Yersinia pestis e Y. enterocolitica • •Citrobacter spp • Serratia Grupos 1- Escherichia 2- Klebsiella-Enterobacter-Serratia 3- Proteus-Morganell-Providencia 4- Citrobacter 5-Shigelas 6 – Salmonelas 7- Outras enterobacteriaceae
Identificação de Enterobactérias Classificação - patogenia - Enteropatógenos - Infecções nosocomiais - espécies importantes - Outras espécies - raras em material clínico isoladas em : meio ambiente plantas animais
Família Enterobacteriaceae Patogenia Enterobactérias- principal componente da flora intestinal normal do homem. • Infecções -intestinal, feridas e trato urinário • Abcessos, pneumonia, meningites • Infecções nosocomiais
Família Enterobacteriaceae Patogenia • Infecções intestinais • Características • normalmente na comunidade • DTA – doença transmitida por alimento • surtos / casos isolados • hospitalar • Patógenos entéricos clássicos • Salmonella spp • Shigella spp • E.coli - categorias diarreiogênicas • Yersinia enterocolitica
Família Enterobacteriaceae Patogenia Espécies mais comuns Escherichia coli Klebsiella pneumoniae Klebsiella oxytoca Proteus mirabilis Enterobacter spp Salmonella ( sorotipos) Serratia marcescens Citrobacter spp Providencia spp • Infecções extra-intestinais • Comunidade • Hospitalar • Qualquer espécie • Fatores de risco: • Paciente • Veículos de transmissão • Alimentos contaminados
Família Enterobacteriaceae ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DE ENTEROBACTÉRIAS Crescem bem nos meios comuns e meios seletivos para BGN ( 18 a 24h 1 mm de diâmetro). • A enterobactéria sempre cresce nos meios ricos (ágar sangue, chocolate), bem como nos meios seletivos: ágar Mac Conkey e Salmonella-Shigella • Os Gram positivos como regra não crescem em ágar Mac Conkey e Salmonella-Shigella, exceto os enterococos que podem crescer • No ágar Mac Conkey e Salmonella-Shigella, além das enterobactérias e dos enterococos, podem • crescer bactérias não fermentadoras e Candida Secreções: ágar sangue e Mac Conkey Líquidos nobres e biópsias: Ágar Chocolate e Mac Conkey Fezes: Mac Conkey e Salmonella-Shigella Urina: CLED ou ágar sangue e Mac Conkey, etc.
Família Enterobacteriaceae ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DE ENTEROBACTÉRIAS • 1- Exame macroscópico da cultura: • Aspecto morfológico das colônias • Tempo de crescimento e tamanho da colônia • Observar pureza da cultura • 2-Exame microscópico da cultura: • Gram: tamanho, morfologia, reação tintorial, etc
Aspecto das colônias Agar MacConkey
Aspecto das colônias E.coli Salmonella. E.cloacae
Família Enterobacteriaceae Identificação Bioquímica ( cultura pura) Principais provas para a identificação das enterobactérias de importância clínica 1. Fermentação da glicose 2. Fermentação da lactose 3. Motilidade 4. Utilização de citrato 5. Descarboxilação da lisina 6. Produção de sulfeto de hidrogênio (H2S) 7. Produção de gás (CO2) 8. Oxidase 9. Produção de indol 10. Produção de urease 11. Produção de fenilalanina desaminase ou opção triptofanase 12. Produção de gelatinase ou opção DNAse
Família Enterobacteriaceae Identificação Bioquímica ( cultura pura) • Provas complementares de Identificação • Fermentação de outros carboidratos: sacarose, maltose, arabinose, salicina, dulcitol, manitol, etc. • Utilização de aminoácidos: arginina e ornitina • Hidrólise da esculina, etc. • Utilização de acetato • Provas úteis, mas pouco utilizadas: vermelho de metila (VM), voges-proskauer (VP), crescimento em KCN, tartarato de jordan e lipase. Esquemas de identificação - determinação dos gêneros e espécies mais isolados na clínica, utilizando provas características de cada gênero e espécie. Critérios para identificação - facilidade de execução, facilidade de interpretação, custo, rapidez para leitura
Família Enterobacteriaceae Identificação Bioquímica ( cultura pura) • Meios presuntivos • IAL (Pessoa e Silva) • EPM-MILI • TSI
Família Enterobacteriaceae Identificação Bioquímica ( cultura pura) Meios presuntivos IAL (Pessoa e Silva) - “Instituto Adolfo Lutz” – triagem de enterobactérias – 9 provas em apenas um tubo de ensaio: indol (tampa), fermentação da sacarose e glicose e produção de gás, fenilalanina, uréia, H2S, Lisina, Motilidade Baseado nestas provas é possível identificar as seguintes bactérias: - E. coli - Shigella (indol positiva) - Shigella (indol negativa) - Enterobacter aerogenes - Klebsiella pneumoniae - Klebsiella spp. (sacarose negativa) - Enterobacter cloacae - Providencia spp. (uréia positiva) ou Morganella morganii - Providencia spp. (uréia negativa) - Proteus mirabilis - Proteus vulgaris - Salmonella spp. - Salmonella typhi - Citrobacter freundii - Serratia marcescens (provas complementares) - Vibrio cholerae - Vibrio spp. - bactérias não fermentadoras Meio IAL - vantagem = prático para inoculação e de baixo custo - desvantagem = dificuldade de interpretação de tantas provas (experiência)
Família Enterobacteriaceae Identificação Bioquímica ( cultura pura) Meios presuntivos EPM-MILI-Citrato - mesma combinação de reações do meio IAL ou Rugai (fenilalanina, fermentação da glicose, gás, H2S, uréia), separados em 2 tubos, passando a verificação do indol da tampa do IAL, para o meio MILi após adição do reativo de Kovacs
Família Enterobacteriaceae Identificação Bioquímica ( cultura pura)
Família Enterobacteriaceae Identificação Bioquímica ( cultura pura) Meios presuntivos TSI – Tríplice Açucar Ferro - O meio de TSI é inclinado em bico de flauta, de cor vermelho-cereja e deve ser inoculado por picada central até o fundo, seguido de espalhamento na superfície e incubação durante 18-24h a 35oC a) Púrpura/amarelo (ápice púrpuro e base amarela) = fermentação apenas da glicose (lactose e sacarose negativas) b) Amarelo/amarelo (ápice e base amarelos) = fermentação da glicose + lactose e/ou sacarose (2 ou 3 açúcares) c) Presença de gás (CO2) = bolhas ou meio fragmentado d) H2S positivo = presença de precipitado negro
Família Enterobacteriaceae Identificação Bioquímica ( cultura pura)
Família Enterobacteriaceae Identificação Bioquímica ( cultura pura)
Família Enterobacteriaceae Identificação Bioquímica Provas complementares: Fermentação de açúcares Pesquisa de enzimas DNase gelatinase,lipase Série completa - 47 testes vermelho de metila (VM) produção de acetilmetilcarbinol a partir dextrose - voges-proskauer (VP) Gram Oxidase VM e VP
Família Enterobacteriaceae Reação de VM e VP vermelho de metila (VM), voges-proskauer (VP), Enterobactérias VP+ Enterobactérias VP - • Maioria das espécies dos outros Gêneros • Salmonella • Shigella • E.coli • Proteus • Morganella • Providencia • Citrobacter • Kluyvera • Enterobacter • Klebsiella • Serratia
Família Enterobacteriaceae Identificação Gram da colônia isolada – sempre fazer o Gram para evitar enganos de interpretação (diferenciar cocos de bacilos, Gram positivos de Gram negativoe e leveduras). Prova da oxidase – indicada para detectar e/ou diferenciar o grupo Aeromonas, Plesiomonas, Vibrio que também são fermentadores. Prova do metabolismo fermentador – triagem utilizando os meios de OF glicose (quando suspeitar de não fermentador), TSI (Tríplice Açucar Ferro) ou EPM (Rugai sem sacarose), para enterobactérias. Série bioquímica complementar – sempre necessária para caracterizar gênero e espécie. O número de provas vai permitir maior ou menor discriminação • A fonte de informação mais utilizada baseia-se na tabela organizada por Farmer (1991) contando com 47 provas, e os respectivos percentuais de positividade para 28 diferentes gêneros e 121 espécies de enterobactérias. Os principais gêneros e espécies de importância clínica podem ser caracterizados com >95% de acerto com poucas provas • Valores positivos ou negativos referem-se a 80% ou mais de definição • PB (padrão bioquímico) = probabilidade teórica da bactéria em questão; apresentar o padrão • bioquímico analisado (Exemplo: PB para Proteus vulgaris em relação às provas, H2S +(98%) FA +(95%) Indol + (98%) (multiplicar os percentuais de ocorrência)= 92% • PB baixo significa ter outro padrão mais frequente
Fluxograma identificação bacilos gram negativos BGN Oxidase Lac - Lac + Ágar Mac Conkey IAL IAL Shigella Salmonella Serratia Proteus Providencia Morganella E.coli Enterobacter Klebsiella Kluyvera Citrobacter Salmonella Serratia Proteus/Prov.(V) Enterobacter Klebsiella Kluyvera Citrobacter VP + + + Cit. Simmons Cit. Simmons - - Shigella Morganella E.coli
Enterobacteriaceae Identificação Sorológica Importância dos Ag da parede celular Enterobactérias Antígeno completo denominadas lisas Que não contem rugosas • LPS Antígeno somático O polissacarídico Polissacárido do core (comum a todas) Lipidio A •Antígeno K (Kapsel) = cápsula, proteico ou polissacarídico •Antígeno H = proteínas flagelares (flagelina). Enterobactérias móveis A classificação antigênica das Enterobacteriáceas baseia-se na presença dos Ags O, K, e H e detecta-se por aglutinação com soros específcos
Família Enterobacteriaceae Identificação Sorológica Sorotipos são divisões baseadas no relacionamento antigênico Biotipos são amostras do mesmo sorotipo que diferem em características bioquímicas Em atividades de rotina de Bacteriologia Clínica, a identificação ou confirmação sorológica é feita apenas com germes comprovadamente patogênicos e de importância epidemiológica como Salmonella spp., Shigella spp., Escherichia coli Yersina enterocolitica • Gota do anti-soro (coelhos: polivalente – Ac contra várias enterobactérias • monovalente – Ac individuais contra antígenos O, K e H Suspensão densa (leitosa) bactéria salina 0,85% Aglutinação Teste positivo
Gênero:Escherichia Compreende as espécies E. coli, E. hermanii, E. fergusonii, E.vulneris e E. blattae. Seis são as categorias de E. coli enteropatogênicas: E. coli enteropatogênica clássica (EPEC), E. coli enterotoxigênica (ETEC), E. coli enteroinvasiva (EIEC), E. coli enterohemorrágica (EHEC) E. coli enteroaderente (EAEC) e E. coli enteroagregativa (EAggEC). Trato unrinário , doenças diarréicas , sepse , meningite
E. coli Identificação Sorológica
Gênero: Salmonella Bactéria do gênero Salmonella vista por microscopia eletrônica. Bactéria do gênero Salmonella vista por microscopia eletrônica. Febre entérica (febre tifóide), bacteremia com lesões focais , enterocolite
Salmonella Identificação Sorológica a) Anti-Salmonella polivalente somático (Grupos A,B,C,D,E) b) Anti-Salmonella somático, Grupo D (S. typhi) c) Anti-Salmonella, anti Vi
Gênero: Klebsiella Trato respiratório – pneumonias (3%)
Gênero:Enterobacter,Citrobacter Serratia,Providencia • Estão associadas a infecções hospitalares • Observa-se resistência a múltiplos antibióticos • Enterobacter – capsulas pequenas – trato intestinal, urinaria e sepse • Serratia – pneumonia, bacteremia e endocardite (pacientes viviados em narcotios)
Gênero: Yersinia Composto de no mínimo sete espécie • Yersinia Pestis • Agente causador de uma das doenças mais devastadora na história • Peste urbana e peste silvestre • Peste bubônica e peste pneumônica • Yersinia enterocolítica • Causam enterocolite • gastroenterite diarréia, febre e dor abdominal
Yersinia enterocolítica Yersinia Pestis Image Courtesy: Wyoming Animal Health and Disease Information Network Ágar MacConkey
Gênero:Proteus Proteus mirabilis Associadas a infecção urinárias As cepas produz grandes quantidades de urease que degrada a uréiacom Co2 e NH3 eleva o Ph da urina facilitando a formação de cálculos renais
Tratamento • Escherichia coli e Proteus mirabilis: são suscetíveis a vários antibióticos • A maioria das enterobactérias são sensíveis a cefalosporina, aminoglicosídeos, tetraciclinas, cloranfenicol, cotrimoxazol e aos derivados de quilônicos • Proteus,Providencia e Serratia resistentes a polimixinas • Klebsiella,Enterobacter e Serratia resistencia a ampicilina
Prevenção e Controle Infecção endógena difícil de ser controlada Evitar o uso irrestrito de antibióticos-> resistência bacteriana Infecção exógenamais fácil controle Eficaz com educação e introdução de procedimentos adequados de controle de infecçao p.ex.: lavar bem as mãos E eliminação de roupas sujas em meio com surto identificado
Bastonetes Gram negativos não fermentadores • bacilos Gram negativos classificados como não fermentadores (BNFs) são microrganismos aeróbios, não esporulados, que se caracterizam pelo fato de serem incapazes de utilizar carboidratos como fonte de energia através de fermentação, degradando-os pela via oxidativa • A maioria dos laboratórios de microbiologia clínica não realiza provas de identificação desses microrganismos visto a pouca incidência em amostras ambulatoriais A caracterização é importante nos casos de infecção hospitalar , embora a incidencia seja pequena, mas esses microrganismos apresentam resistência elevada a vários antibióticos e são capazes de causar infecções graves
Bastonetes Gram negativos não fermentadores BNFs de importância clínica
Bastonetes Gram negativos não fermentadores Testes para identificação de BNFs
Bastonetes Gram negativos não fermentadores Testes para identificação de BNFs
Bastonetes Gram negativos não fermentadores Testes para identificação de BNFs
Bastonetes Gram negativos não fermentadores Testes para identificação de BNFs