HLA systém (MHC glykoproteiny)

1. HLA systém (MHC glykoproteiny)

2. MHC glykoproteiny I. třídy (major histocompatibility complex) • Funkcí MHC gpI je prezentace peptidových fragmentů, které jsou produkovány buňkou (včetně virových, pokud jsou přítomny), na buněčném povrchu tak, aby byly rozpoznávány T lymfocyty (cytotoxickými CD8) • Přítomny na všech jaderných buňkách organismu • 3 izotypy klasických lidských MHC gp. ( HLA - A, -B, -C ) • 3 izotypy neklasických MHC gp. ( HLA – E, -F, -G; molekuly CD1)

3. Prezentace peptidového fragmentu pomocí MHC gp I. třídy cytotoxickému T lymfocytu

4. Struktura MHC gp I • MHC gp. I. třídy se skládají z transmembránového řetězce aa nekovalentně asociovaného b2mikroglobulinu • Řetězec a má 3 domény, 2 N-terminální (a1, a2 – vazebné místo pro peptidy) a 1 C-terminální doménu (a3 – zakotvena v cytoplazmatické membráně) • Vazba peptidu je nezbytná pro stabilní konformaci MHC gp a tím zajišťuje jeho dlouhodobou prezentaci na buněčném povrchu

5. Vazba peptidů na MHC gp I • MHC gp I váží peptidy o délce 8 až 10 AK • Určitá molekula MHC gp váže peptidy sdílející společné strukturní rysy - vazebný motiv (rozhodující jsou AK poblíž konců peptidu) • K vazbě endogenních peptidů dochází v endoplazmatickém retikulu během biosyntézy MHC gp. • Po vytvoření řetězce a a b2mikrotubulinu dochází v ER k poskládání do správné konformace a k vzájemné asociaci a k asociaci vhodného peptidu, tento komplex je dále zpracován v Golgiho aparátu a pak je prezentován na buněčném povrchu • Navázané peptidy pocházejí z proteinů degradovaných proteazómem, který štěpí cytoplasmatické proteiny určené k likvidaci (označené ubiquitinem), peptidové fragmenty jsou transportovány do ER pomocí specifických membránových pump

6. Vazba peptidů na MHC gp I

7. Vazba peptidů na MHC gp I

8. Neklasické MHC gp. I • HLA – E, -F, -G; molekuly CD1 • Strukturně podobné klasickým MHC gp • Jsou méně polymorfní • Vyskytují se jen na některých buňkách • Specializují se na vazbu zvláštních ligandů

9. HLA-E a HLA-G - vyskytují se na buňkách trofoblastu • Komplexy HLA-E a HLA-G s peptidy jsou rozpoznávány inhibičními receptory NK buněk a přispívají k toleranci plodu v děloze

10. MHC glykoproteiny II. třídy • Funkcí MHC gp II je prezentace peptidových fragmentů z proteinů pohlcených buňkou tak, aby byly rozpoznatelné T lymfocyty (pomocnými CD4) • Vyskytují se na APC ( dendritické buňky, monocyty, makrofágy, B lymfocyty) • 3 izotypy MHC gp II ( DR, DQ, DP )

11. Struktura MHC gp II • MHC gp. II se skládají ze 2 nekovalentně asociovaných transmembránových podjednotek a a b • Vazebné místo pro peptid je tvořeno N-terminálními doménami a1 a b1 • Vazba peptidu je nezbytná pro stabilní konformaci MHC gp a tím zajišťuje jeho dlouhodobou prezentaci na buněčném povrchu

12. Vazba peptidů na MHC gp II • MHC gp II váží peptidy o délce 15 až 35 AK (ale i delší - vazebné místo pro peptid je na obou koncích otevřené) • Určitá molekula MHC gp váže peptidy sdílející společné strukturní rysy - vazebný motiv • Po vytvoření řetězce a a b v ER dochází k poskládání do správné konformace a k vzájemné asociaci a k připojení dalšího transmembránového řetězce, tzv. invariantního řetězce, který blokuje vazebné místo pro peptid, tento komplex je dále zpracován v Golgiho aparátu; sekreční váčky oddělené od GA fúzují s endozómy, poté se rozštěpí invariantní řetězce a do vazebného místa MHC gp se naváží peptidové fragmenty endocytovaných proteinů a poté je komplex prezentován na buněčném povrchu

13. Vazba peptidů na MHC gp II

14. Antigenní prezentace

16. Prezentace antigenu T lymfocytům Signál TCR – MHC gp I(II)+Ag peptid (APC) Signál kostimulační CD 28 (Tlymfocyt) – CD 80, CD 86 (APC)

17. Polymorfismus MHC glykoproteinů • HLA komplex se nachází na chromozómu 6 • U MHC gp je vysoký polymorfismus, tzn. existují až stovky různých alelických forem jednotlivých izotypů (kromě neklasických MHC gp. I a kromě DR řetězce a) • Kodominantní dědičnost alelických forem(jedinec má na povrchu buněk 3 izotypy HLA molekul (HLA-A, -B, -C) většinou ve 2 různých alelických formách) • Polymorfismus má ochranný význam na úrovni jedince i na úrovni populace • Polymorfismus MHC gp způsobuje komplikace při transplantacích

18. HLA typizace= určení HLA antigenů na povrchu lymfocytůProvádí se při předtransplantačním vyšetření a při určení paternity 1) Sérologická typizace • mikrolymfocytotoxický test • allospecifická séra ( získaná od vícenásobných rodiček do 6 týdnů po porodu, získaná vakcinací dobrovolníků, nebo komerčně připravené sety typizačních sér (monoklonální protilátky)) • princip - inkubace lymfocytů s typizačními séry za přítomnosti králičího komplementu, poté je přidáno vitální barvivo, které obarví mrtvé buňky - buňky nesoucí určité HLA jsou usmrceny cytotoxickými Ab proti tomuto Ag, procento mrtvých buněk je mírou toxicity séra (síly a titru antileukocytárních protilátek) • za pozitivní reakci se považuje více než 10% mrtvých bb. • (sérologickou typizaci lze provádět i pomocí průtokové cytometrie)

19. 2) Molekulárně genetické metody • Pro typizaci se používají hypervariabilní úseky ve II. exonu genů kódujících HLA II. třídy, pro určení HLA I. třídy se používá polymorfismus v II. a III. exonu kódujících genů 2a) PCR-SSP • = polymerázová řetězová reakce se sekvenčními specifickými primery • extrahovaná DNA slouží jako substrát v sadě PCR reakcí • každá PCR reakce obsahuje primerový pár specifický pro určitou alelu (resp. skupinu alel) • pozitivní a negativní reakce se hodnotí elektroforézou • každá kombinace alel má svůj specifický elektroforetický obraz

20. 2b) PCR-SSO • = PCR reakce se sekvenčně specifickými oligonukleotidy • namnoží se hypervariabilní úseky genů kódujících HLA • hybridizace s enzymaticky nebo radioaktivně značenými DNA sondami specifickými pro jednotlivé alely 2c) PCR- SBT • = sequencing based typing; sekvenování • nejpřesnější metodika HLA typizace • získáme přesnou sekvenci nukleotidů, kterou porovnáme s databází známých sekvencí HLA alel

21. Imunoglobuliny

22. Struktura imunoglobulinů • 2 těžké (H) řetězce kovalentně spojeny cystinovými můstky, ke každému H řetězci je cystinovým můstkem připojen lehký (L) řetězec • H řetězec se skládá ze 4 až 5 domén (1 variabilní, 3-4 konstantní) • L řetězec se skládá ze 2 imunoglobulínových domén (1 variabilní, 1 konstantní) • Typy L řetězců - k,l • Typy H řetězců – m, d, g (g1-4), a (a1,a2), e

24. Variabilní domény L a H řetězce tvoří vazebné místo pro Ag • Pantová oblast = místo, kde jsou těžké řetězce spojeny cystinovými můstky • Fc části imunoglobulínů jsou silně glykosilovány, váží se na Fc receptory • J řetězec • Sekreční komponenta

25. Funkce imunoglobulinů • Neutralizace Ag • Aglutinace Ag • Aktivace komplementu • Opsonizace • Aktivace mastocytů prostřednictvím IgE • ADCC

26. Funkce imunoglobulinů

27. Třídy imunoglobulínů a jejich funkce • Rozlišujeme podle konstantní části H řetězce • IgM, IgD, IgG ( IgG1 – IgG4), IgA (IgA1, IgA2), IgE • IgM - jako monomer tvoří BCR - sekretovaný ve formě pentamerů (10 vazebných míst) - první izotyp, který se tvoří po setkání s Ag - neutralizace Ag, aktivuje komplement, neváže se na Fc receptory fagocytů - (koncentrace 0,9 – 2,5 g/l; biol. poločas 6 dnů) • IgD - jako monomer tvoří BCR - v séru se nachází ve velmi malé koncentraci - (koncentrace 0,1 g/l; biol. poločas 3 dny)

28. IgG - jednotlivé izotypy IgG1-IgG4 se liší schopností aktivovat komplement a vázat se na Fc receptory fagocytů (opsonizace) - funkce: neutralizace, opsonizace, aktivace komplementu - přestupuje placentou - tvořen při sekundární imunitní odpovědi - (koncentrace 8 – 18 g/l; biol. poločas 21 dnů)

29. IgA - slizniční IgA -ochrana sliznic, neutralizace, opsonizace, neaktivuje komplement - dimér se sekreční komponentou - sliny, slzy, mateřské mléko - sérový IgA – monomer, dimer či trimer - (koncentrace 0,9 – 3,5 g/l; biol. poločas 6 dnů) • IgE - uplatňuje se při obraně proti mnohobuněčným parazitům - je hlavní příčinou alergických reakcí - (koncentrace 3x10-4 g/l; biol. poločas 2 dny)

31. Genetický základ tvorby imunoglobulinů

32. Genové segmenty pro H řetězce - chromozóm 14 • V (variabilita) - několik set • D (diversita) - asi 50 • J (joining) – 9 • C konstantní části H řetězce • Genové segmenty pro L řetězce - k chromozóm 2 - l chromozóm 22 • V (variabilita) • J (joining) • C konstantní části L řetězce • Na koncích V, D, J úsekůjsou signální sekvence, které jsou rozpoznávány enzymy rekombinázami, které provádějí přeskupování těchto genů • Po stranách C segmentů jsou tzv. switch sekvence (přesmykové), které jsou rozpoznávány enzymy rekombinázami, které provádějí izotypový přesmyk

33. Přeskupování genů kódujících H řetězce • D-J přeskupení- vyštěpení úseku IgH mezi některýmDaJsegmentem (probíhá na obou chromozómech) • V-D přeskupení – vyštěpení úseku mezi některýmVsegmentem aDJ; pokud je přeskupení na některém z chromozómů úspěšné, zastaví se přeskupování na druhém chromozómu – tzv. alelická exkluze( to platí i pro L řetězce) Přepis přeskupeného IgH genu do mRNA, sestřih primárního transkriptu. Jako první se tvoří H řetězce m. Není-li přeskupování úspěšné, B lymfocyt hyne.

34. Přeskupování genů kódujících L řetězce • Nejprve se přeskupují geny kódující L řetězec k, dochází k vyštěpování úseků mezi některým V a J segmentem (souběžně na obou chromozómech), pokud je přeskupení na některém z chromozómů úspěšné, zastaví se přeskupování na druhém chromozómu – tzv. alelická exkluze. • Jestliže není přeskupování k genů úspěšné, zahájí se přeskupování genů l. • Ne všechny H a L řetězce mohou spolu tvořit stabilní dimery. Není-li přeskupování úspěšné, B lymfocyt hyne.

35. Izotypový přesmyk (class switch) • Dochází k němu během terminální diferenciace B lymfocytu po aktivaci Ag na povrchu FDC (nezbytný kostimulační signál přes CD40) • Enzymy rekombinázy rozpoznávají switch sekvence lokalizované po stranách C segmentů (tato sekvence není mezi Cm a Cd segmenty – B buňka může před izotypovým přesmykem produkovat IgM i IgD zároveň)a vyštěpují úseky genů • Po eliminaci části C oblasti je do mRNA přepsán ten segment, který je nejblíže VDJ segmentu a po sestřihu a translaci vzniká příslušný izotyp H řetězce

37. Izotypový přesmyk (class switch) - pokračování • Cytokiny regulují k jakému izotypovému přesmyku dojde: • IL-4 stimuluje přesmyk na IgE a IgG1, IgG4 • TGFb stimuluje přesmyk na IgG2 a IgA

38. Antiidiotypové protilátky • IDIOTOP = každá determinanta variabilní části protilátky, může být součástí paratopu, či může ležet mimo paratop • IDIOTYP = soubor idiotopů; souhrn identických vazebných struktur pro Ag na protilátkách stejné specifity • Idiotypické struktury protilátek 1. generace jsou rozpoznávány některými B lymfocyty jako antigeny a mohou se proti nim tvořit tzv. antiidiotypové protilátky (protilátky 2. generace; některá vazebná místa mohou připomínat Ag, který vyvolal tvorbu protilátek 1. generace) • Proti protilátkám 2. generace se tvoří protilátky 3. generace (anti-antiidiotypové protilátky) • Tato idiotypová síť může hrát roli v regulaci protilátkové odpovědi

39. T lymfocyty J. Ochotná

40. T lymfocyty • T lymfocyty patří mezi buněčnou složku antigenně specifických mechanismů, při vývoji opouštějí kostní dřeň a migrují do thymu, kde dozrávají • Existuje několik různých subpopulací T lymfocytů • Podílejí se na regulaci imunitních dějů, při likvidaci virem infikovaných buněk či nádorových buněk • Rozpoznávají antigen zpracovaný a prezentovaný APC; prostřednictvím TCR rozpoznávají komplex MHC gp-antigenní peptid • T lymfocyty jsou po aktivaci stimulovány k pomnožení a diferenciaci v efektorové buňky, část se diferencuje v paměťové buňky

41. Vývoj T lymfocytů • T lymfocyty vznikají v kostní dřeni a pak migrují do thymu, kde dozrávají (abT lymfocyty), konečná diferenciace probíhá až po aktivaci antigenem zpracovaným a prezentovaným APC • gdT lymfocyty se mohou vyvíjet i mimo thymus (jde o menšinovou populaci) Pluripotentní hematopoetickákmenová buňka Pro-thymocyt – dostává se z kostní dřeně do thymu, kde se začínají přeskupovat geny pro TCRb, exprimuje na svém povrchu tzv. pre-TCR (složený z b řetězce, pre-TCRa a CD3 komplexu), po té se začínají přeskupovat geny pro TCRa Kortikální thymocyt – exprimuje na svém povrchu TCR (složený z řetězců ab a CD3) a koreceptory CD4 a CD8; v této fázi dochází k selekci autoreaktivních buněk a buněk s nefunkčním TCR Medulární thymocyt (zralá T buňka) – zachovávají si expresi CD4 či CD8, usidlují se v sekundárních lymfoidních orgánech

42. Selekce T lymfocytů • Negativní selekce – eliminace autoreaktivních buněkPokud thymocyt váže svým TCR dostatečně silně komplex MHCgp s normálními peptidy (z autoantigenů) se kterými se setká na povrchu thymových buněk dostane signály vedoucí k apoptotické smrti buňky PAE buňky (peripherial antigen expressing cells) • Pozitivní selekce – eliminace buněk s nefunkčním TCR Pozitivně selektovány jsou thymocyty, které s nízkou afinitou rozeznávají MHC gp, ty si pak zachovávají expresi CD4 či CD8 (váže-li příslušný TCR MHC gp I či II) – tyto zralé T bb. (medulární thymocyty) opouštějí thymus a usidlují se v sekundárních lymfoidních orgánech • 98% pro-thymocytů v thymu během svého vývoje zahyne

43. Vývoj T lymfocytů

44. Povrchové znaky T lymfocytů • TCR – rozpoznává Ag peptid v komplexu s MHC gp • CD3 – součást TCR, účast při přenosu signálu • CD4 nebo CD8 – koreceptory, napomáhají k vazbě na MHC gp • CD28 – kostimulační receptor; váže CD80, CD86 • CTLA-4 (CD152) – inhibiční receptor; váže CD80, CD86

46. Subpopulace T lymfocytů • ab-T lymfocyty– mají TCRab, většinový typ (95%), k vývoji potřebují thymus, rozeznávají antigeny v komplexu MHC gp-peptid • gd-T lymfocyty – (5%) mohou se vyvíjet i mimo thymus, některé jsou schopny rozpoznat nativní Ag, uplatňují se při obraně kůže a sliznic • Intraepiteliální T lymfocyty • NK-T lymfocyty – rozeznávají komplexy CD1 molekul s lipidy

47. ab-T lymfocyty Exprimující koreceptor CD4(koreceptor pro MHC gp II)Jde o prekurzory pomocných T buněk (TH), ty lze rozdělit podle produkce cytokinů na :TH0 – produkují směs cytokinů jako TH1 a TH2 TH1 – IL-2, IFNg (pomoc makrofágům)TH2 – IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 (pomoc B lymfocytům) TH3 – TGFb Treg – regulační T lymfocyty, potlačují aktivitu TH1 a částečně fungují jako TS, potlačování autoreaktivních klonů T lymfocytů; produkují IL-10 a TGFb

48. ab-T lymfocyty Exprimující koreceptor CD8(koreceptor pro MHC gp I)Jde o prekurzory cytotoxických T buněk (TC), či supresorových T buněk (TS)TC– rozeznávají buňky napadené viry či jinými intracelulárními parazity a některé nádorové buňky TS – potlačují funkce ostatních lymfocytů

49. TCR • TCR (T cell receptor) se skládáz modulu rozeznávajícího Aga asociovaného CD3 komplexu,který je nezbytný pro přenossignálu, je propojen s PTK (Src) • Modul rozeznávající Ag je tvořen 2 řetězci a a b (g,d), N-terminální části tvoří vazebné místo pro Ag • T lymfocyty (ab) rozeznávají komplex MHC gp-Ag peptidna povrchu APC, při rozpoznání spolupracuje TCR s koreceptory CD4 (pomáhá vázat MHC gp II) nebo CD8 (pomáhá vázat MHC gp I) • Aktivace přes TCR a CD28 vede k proliferaci a diferenciaci v efektorové buňky • CD28 – receptor kostimulačního signálu, váže ligandy CD80 a CD86, které jsou na povrchu APC

50. Spolupráce TCR s koreceptory CD4 a CD8