Lanthanoide als Marker in der Fluoreszenzspektroskopie

1. Jan Hoyer Nora Schulze Lanthanoide als Marker in der Fluoreszenzspektroskopie

2. Gliederung 1. Vor- und Nachteile von Lanthanoidenmarkern 2. Allgemeine Vorgehensweise 3. Anwendungen 4. Literatur

3. Anforderungen an Markersubstanzen • gutes Signal/Rausch-Verhältnis • kleine Nachweisgrenze • einfache Handhabung; Verfügbarkeit der Substanzen • möglichst geringe Beeinflussung des zu untersuchenden Systems

4. Vorteile von Ln-Fluoreszenzmarkern • keine Strahlenschäden (vgl. radioaktive Marker) • scharfe Banden, geringer Hintergrund  gutes S/N  geringe Nachweisgrenze (bis fmol-Bereich) • kurze Messdauer (Sekundenbereich) • Nachteil: teurer als herkömmliche Fluoreszenzmarker!

5. Besonderheiten der Fluoreszenz bei Lanthanoiden • Lebensdauer des angeregten Zustandes: 0,1 – 1 ms → zeitaufgelöste Unterscheidung von Hintergrundsignal möglich • Stokes-Verschiebung über 250 nm • geringe Extinktionskoeffizienten → geringes Hintergrundsignal → Sensibilisierung durch „Antennenliganden” notwendig • eingesetzte Lanthanoide: Eu, Tb, Sm, Dy

6. Stokes-Verschiebung Abstand zwischen Absorptions- und Emissionsmaximum einer fluoreszierenden Substanz → je größer die Verschiebung, umso weniger Überlappung von Absorptions- und Emissionsspektrum

7. Antennenliganden - Prinzip • Chelatligand bindet Marker und absorbiert eingestrahltes Licht • Energie wird auf Lanthanoidion übertragen und als Fluoreszenzsignal emittiert

8. hohe KoZ verhindert Bindung von Wasser an Ln, da sonst Desaktivierung Antennenliganden - Beispiele

9. Anwendungen • DELFIA („dissociation enhanced lanthanide fluoroimmunoassay“) Immunoassays ähnlich ELISA oder RIA Untersuchung von Rezeptor-Ligand-Interaktionen • TR-FRET („time resolved fluorescence resonance energy transfer“) → z. B. Untersuchung der Oligomerisierung von Rezeptoren in lebenden Zellen • Einführung von Ln-Bindungsstellen in Proteine → unmittelbare Bestimmung von Expressionsleveln → Visualisierung von Proteinen in SDS-PAGE-Gelen

10. DELFIA Beispiel: Bestimmung von Metallothioneinen → Expression u. a. als Antwort auf Kontamination mit Schwermetallionen (Komplexierung) • zunächst Inkubation mit MT-Antikörper, an diesen bindet sekündärer Antikörper →markiert mit nicht-fluoreszierendem Chelatkomplex (z. B. Eu-DTTA, gebunden über Isothiocyanatgruppe an ε-Aminogruppe von Lys) • Erniedrigung des pH führt zu Freisetzung von Ln aus Komplex, Bindung an Antennenliganden → Nachweis

11. Vorteile von DELFIA • empfindlicher als ELISA und RIA • kostengünstiger und weniger zeitaufwändig als RIA, keine radioaktive Strahlung • Möglichkeit der Automatisierung • Verwendung mehrerer Marker gleichzeitig möglich, da unterschiedliche Lebensdauern des angeregten Zustandes und andere Emissionsprofile von Eu, Tb, Sm, Dy → Kosten- und Zeiteinsparung

12. Weitere Möglichkeiten der Verwendung von Lanthanoiden • Lanthaniden-Shift-Reagenzien in NMR • Beschleunigung der Proteinstrukturbestimmung mittels RKSA

13. Quellennachweis • Life Sciences 77 (2005), 361-371 • Analytical Biochemistry 137 (1984), 335-343 • Chembiochem 4 (2003), 265-271