1 / 25

2D gélelektroforézis a proteomikában

2D gélelektroforézis a proteomikában. Bevezetés. Proteomika Proteome: „ the PROTEin complement expressed by a genOME ” (Mark Wilkins, 1994) A proteom a genomról expresszálódott fehérjekészlet. Térben és időben dinamikusan változik

bishop
Download Presentation

2D gélelektroforézis a proteomikában

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. 2D gélelektroforézis a proteomikában

  2. Bevezetés Proteomika Proteome: „the PROTEin complement expressed by a genOME” (Mark Wilkins, 1994) A proteom a genomról expresszálódott fehérjekészlet. Térben és időben dinamikusan változik A proteomika a proteomok jellemzésével foglalkozó tudományág.

  3. Új információk nyerhetőek a különböző állapotú sejtek, organizmusok fehérjekészletének összehasonlításával. - stressztoleranciáért felelős fehérjék - virulenciáért felelős fehérjék - rezisztenciáért felelős fehérjék - betegségek kialakulásáért felelős fehérjék - transzkripciós faktorok célgénjeinek terméke Vizsgálata: Két-dimenziós gélelektroforézis + tömegspektrometria Kvantitatív tömegspektrometria

  4. Miért 2D gél? • A proteomok nagyon komplexek (ember:~200.000 fehérje), ezért szükség van egy elválasztási technikára ami: • reprodukálható • nagy felbontású (1D-kb. 100 fehérjesáv, 2D kb. 10 000 spot) • megengedi a minták kvantitatív összehasonlítását • megengedi a poszt-transzlációs módosítások detektálását

  5. Mi az a 2D gél? • Az első és második dimenziós elválasztás különböző „molekuláris tulajdonság” alapján történik: • Első dimenzió = izoelektromos pont • - izoelektromos fókuszálás • Második dimenzió = molekula tömeg • - SDS-PAGE (nátrium-dodecil-szulfát poliakrilamid-gélelektroforézis)

  6. Izoelektromos fókuszálás SDSPAGE Mintaelőkészítés • Fehérjékazonosítása • MS • Festés és vizualizáció • Spotok kivágása • Gélképek analízise

  7. Mintapuffer • A legtöbb mintapuffer a következő összetevőket tartalmazza: • denaturáló szerek • nem-ionos vagy zwitter-ionos detergensek • redukáló szerek • carrier amfolitok • brómfenolkék

  8. Izoelektromos fókuszálás Mintaelőkészítés

  9. pH 3 pH 10 Izoelektromos fókuszálás • A fehérjék amfoterek, emiatt a töltésük változik a környezetük pH-jától függően • Izoelektromos pont: ezen a pH érteken a fehérje töltése nulla

  10. Strip-ek • Egy kis történelem…… • Patrick O’Farrell: • 1975, J Biol Chem 250, 4007-21 • gél rúd • „mobil” pH gradiens • rossz ismételhetőség • nehéz kezelhetőség Az első

  11. 1982, J.B.B.M. 6: 317-339 • Rögzített pH gradiens • Még mindig nehezen kezelhető • 1988, Electrophoresis, vol 9, p 531 • A gél fóliára rögzítése • Könnyen kezelhető • Reprodukálható Pier Giorgio Righetti

  12. Strip-ek • A pH gradienst tartalmazó nagyon lágy (4%) gél egy vékony fóliához van polimerizálva és rászárítva • Sokféle pH gradiens • (Pl.: 3-10, 4-7, 5-8, 9-11) • Számos méret • (7, 11, 17, 18, 24 cm) • Néhány cégnél lehet a szokásostól eltérő pH tartományú, hosszúságú strip-et rendelni

  13. Izoelektromos fókuszálás Tálcákban történik A stripek olajjal vannak lefedve Limitált áramerősség mellett (50 µA) Magas feszültség mellett (10 000 V, 17 cm-es stripnél) 20 OC-on Általában optimalizálni kell a futtatási időt

  14. Izoelektromos fókuszálás SDSPAGE Mintaelőkészítés

  15. SDS-PAGE • A fehérjéket „beburkoljuk” SDS-el (anionos detergens) ezáltal egységesen negatív töltést kapnak • A fehérjék az anód felé törekszenek, ha elektromos mezőbe helyezzük őket • A fehérjék mozgása a gélben csak a relatív molekula-tömegüktől és az alkalmazott gél pórusátmérőjétől függ

  16. Strip ekvilibrálás • Az elsődleges cél, hogy a fehérjéket SDS-el beburkoljuk • Egyéb célok: • a strip teljes hosszában egységessé tenni a pH-t (1,5 M Tris puffer, pH 8.8) • redukálni (újra) és alkilálni a cisztein oldalláncokat, ezért két lépcsőben történik az ekvilibrálás: • redukálás DTT-vel, a visszaalakult kén hidak megszüntetése a cél

  17. alkilálás jódecetsavval, a redukált cisztein oldalláncok végleges módosítása a cél, de a maradék DTT/DTE is elreagál a jódecetsavval, ezért a redukáló szerekhez képest 3-10-szeres mennyiségben alkalmazzuk. • Az elektro-ozmózis elkerülése miatt a stripeket 20-30% glicerinnel is átitatjuk

  18. SDS-PAGE • A leggyakrabban használt technikák Laemmli 1970-ben publikált technikájára épülnek két fontos különbséggel: • A ‘stacking’ gélt kiváltja a strip, mivel annyira lágy gél, hogy tökéletesen képes azt pótolni • A stripet a szeparáló gél tetejére kell ragasztani felolvasztott agaróz segítségével

  19. Izoelektromos fókuszálás SDSPAGE Mintaelőkészítés • Festés és vizualizáció • Gélképek analízise

  20. Gél festése • Többféle festési eljárás létezik • A három leggyakrabban alkalmazott • Ezüstfestés: nagyon érzékeny, de nem végpontos, ezért nem alkalmas mennyiségi összehasonlításra • Coomassie festés: kevésbé érzékeny, mennyiségi összehasonlításra alkalmas • Fluoreszcens festések (pl.: SyproRuby): nagyon érzékenyek, kvantitatív festés, de detektálásuk drága berendezést igényel

  21. RuBPS Sypro Ruby BioSafe Coomassie Silver

  22. Gél analízis Számítógépes programok segítségével PDQuest, Melanie, Dimension, Phoretix 2D Automatikus spot detektálás és matching A spot kiterjedését és intenzitását veszik figyelembe a mennyiségi analízisnél

  23. Hasznos linkek • http://www.weihenstephan.de/blm/deg/manual/manualwork2html02test.htm • http://www.expressionproteomics.com • http://www.bspr.org/Society_links.html • http://www. proteomicsnetwork.de/ • http://www4.amershambiosciences.com/APTRIX/upp01077.nsf/Content/literature_discussion_groups

More Related