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Real Time qPCR en la mesada

Real Time qPCR en la mesada. Problemas, más y más problemas…. Feliz día a todas las mujeres!. Extracción de RNA. Material de partida. Tubos AXYGEN. Buffer TAE nuevo, Más tiempo NaOH H2O nueva (prep muestras) Loading buffer. EtBr.

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Real Time qPCR en la mesada

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Presentation Transcript

  1. Real Time qPCR en la mesada Problemas, más y más problemas…. Feliz día a todas las mujeres!

  2. Extracción de RNA

  3. Material de partida

  4. Tubos AXYGEN

  5. Buffer TAE nuevo, Más tiempo NaOH H2O nueva (prep muestras) Loading buffer EtBr

  6. Consideraciones para chequear integridad del ARN en gel de agarosa • Tratar cuba electroforética con NaOH 0.5 M por ½ - 1 hora • Usar agua estéril para preparación de buffer • NO reutilizar el buffer • Separar reactivos exclusivamente para RNA (agarosa, EtBr, Loading Buffer) • Correr poco tiempo (ej: 15 min a 100 V) • Siempre usar agua miliQ para preparar muestras

  7. Particularidades… Hígado: - centrifugación luego del TriZol - doble extracción con cloroformo Sangre: - menor volumen de resuspensión (10 – 20 ul) - GlycoBlue

  8. qPCR

  9. ¿¿ Cq > 32/33 ?? SD - RNA realmente íntegro? Degradación post-extracción? • Problema en la qPCR Control + !! - Problema en la RT Enzimas? Pre-amplificación • Gen de baja expresión? Cambiar de gen !!

  10. Nueva tanda de cDNA CHEQUEAR ! Con 1, 2 o 3 cDNAs Pool de cDNAs

  11. Lámpara de excitación? SYBR??

  12. SYBR Estabilidad Inhibición

  13. AMPLIFICA EL NTC !!! • Dímeros de primer ?? • Contaminación ??

  14. Dímeros de primer - Diseñar nuevos - T annealing - Cc usada

  15. Contaminación

  16. Lidiando con las contaminaciones… • Juego de pipetas exclusivo • NEVER IN THE LIFE sembrar los productos de PCR con esas pipetas • Gel agarosa en sala aparte • No mezclar por pipeteo • Alicuotar reactivos • Stock de primers: tips con filtro, alicuotar!! • Hacer SIEMPRE blanco de reacción (NTC) para cada gen

  17. Construyendo una Curva Standard…

  18. Curva Standard Ef = 10 ^ - (1/Pend)

  19. Puntos a tener en cuenta… • cDNA a utilizar • Temperatura de annealing (1,6  1,9) • Puntos de la curva!!! • muy concentrados: se va de la linealidad • NO incluir diluciones 1/10 – 1/20 • muy diluidos: dispersión de los datos / problemas con blancos!!

  20. Persevera….. ….. Y triunfarás!!

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