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Real Time qPCR en la mesada. Problemas, más y más problemas…. Feliz día a todas las mujeres!. Extracción de RNA. Material de partida. Tubos AXYGEN. Buffer TAE nuevo, Más tiempo NaOH H2O nueva (prep muestras) Loading buffer. EtBr.
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Real Time qPCR en la mesada Problemas, más y más problemas…. Feliz día a todas las mujeres!
Buffer TAE nuevo, Más tiempo NaOH H2O nueva (prep muestras) Loading buffer EtBr
Consideraciones para chequear integridad del ARN en gel de agarosa • Tratar cuba electroforética con NaOH 0.5 M por ½ - 1 hora • Usar agua estéril para preparación de buffer • NO reutilizar el buffer • Separar reactivos exclusivamente para RNA (agarosa, EtBr, Loading Buffer) • Correr poco tiempo (ej: 15 min a 100 V) • Siempre usar agua miliQ para preparar muestras
Particularidades… Hígado: - centrifugación luego del TriZol - doble extracción con cloroformo Sangre: - menor volumen de resuspensión (10 – 20 ul) - GlycoBlue
¿¿ Cq > 32/33 ?? SD - RNA realmente íntegro? Degradación post-extracción? • Problema en la qPCR Control + !! - Problema en la RT Enzimas? Pre-amplificación • Gen de baja expresión? Cambiar de gen !!
Nueva tanda de cDNA CHEQUEAR ! Con 1, 2 o 3 cDNAs Pool de cDNAs
SYBR Estabilidad Inhibición
AMPLIFICA EL NTC !!! • Dímeros de primer ?? • Contaminación ??
Dímeros de primer - Diseñar nuevos - T annealing - Cc usada
Lidiando con las contaminaciones… • Juego de pipetas exclusivo • NEVER IN THE LIFE sembrar los productos de PCR con esas pipetas • Gel agarosa en sala aparte • No mezclar por pipeteo • Alicuotar reactivos • Stock de primers: tips con filtro, alicuotar!! • Hacer SIEMPRE blanco de reacción (NTC) para cada gen
Curva Standard Ef = 10 ^ - (1/Pend)
Puntos a tener en cuenta… • cDNA a utilizar • Temperatura de annealing (1,6 1,9) • Puntos de la curva!!! • muy concentrados: se va de la linealidad • NO incluir diluciones 1/10 – 1/20 • muy diluidos: dispersión de los datos / problemas con blancos!!
Persevera….. ….. Y triunfarás!!